最新内分泌细胞学技术文档格式.docx

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常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。

实际应用时，应针对不同的组织来源，采用不同的类型和酶浓度。

经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。

（一）筛网过滤法选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌的筛网过滤，孔径比细胞大的物质便留在筛网上。

该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块如除去包膜的脾脏细胞等是有效的，而对于其他细胞如胰岛等则需进一步的纯化。

（二）密度梯度离心使用不同浓度的Ficoll（含葡聚糖）形成不同的密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞[1]。

经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。

（三）显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大（如胰岛）或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的[2]。

（四）选择性培养在培养基中加入非目的细胞的特异性抑制物，使得非目的细胞不能增殖并诱发其凋亡，从而使细胞达到纯化[3]。

该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。

（五）流式细胞技术将细胞荧光染色（对细胞无毒，仍可存活）后，在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50~100μm的小孔并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。

通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。

如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离[4]。

（六）共聚焦激光扫描显微镜技术利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆粘附细胞。

二、离体细胞的培养

（一）培养液由基本培养基及补充物所组成，对来源于体液的细胞如外周血淋巴细胞而言，选用RPMI1640培养液较好。

对贴壁培养的细胞，可选用DMEM、MEM、F12、McCoy’S5A,F10或DMEM/F12混合物。

其中F12、F10较常用于成纤维细胞的培养，DMEM、MEM、McCoy’S5A较常用于上皮细胞的培养。

同一类型的基本培养基其组成成份不同，有高糖型、低糖型，有些含有酚红。

对于高糖需要型细胞如胰岛培养，则选用高糖型培养液。

而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。

补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法如表1-14-1。

表1-14-1生长因子及激素的配制和使用

溶剂

贮存浓度

贮存温度（℃）

使用浓度

L-抗坏血酸

PBS

50mg/ml

4

25μg/ml~100μg/ml

上皮生长因子（EGF）

H2O

2μg/ml

-20

1ng/ml

成纤维细胞生长因子

5ng/ml

丙酮酸钠

100mM

1mM

氢化可的松

95%乙醇

2×

10-4M

10-6M

地塞米松

10-5M

10-7-10-8M

雌激素

10-3M

10-8M

维生素A酸

胰岛素

0.01NHCl

1mg/ml

5μg/ml

动物血清常用5%~15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中的各种生长因子、激素及免疫球蛋白等吸附去除（炭吸附血清，CS-FBS），以满足细胞培养中的特殊需要[5]。

我们用0.1%BSA（牛血清白蛋白）代替CS-FBS用于肿瘤细胞的培养，效果良好[6]。

同时Sigma公司有去除不同细胞因子和激素的血清替代物出售（serumreplacement），它们亦能满足特殊培养中的部分需要。

（二）培养介质除血液、脾脏、胸腺等来源的细胞外，哺乳动物细胞的培养一般采用贴壁培养。

将分离后的细胞加入适量培养液（占培养空间的5%~20%，V/V），置于37℃、5%CO2、95%空气及保和湿度下培养，而昆虫细胞如Sf9细胞则不能耐受37℃的高温[7]，最适培养温度为27℃。

原代贴壁培养的细胞在培养的前2~3天保持不动，以保证细胞有充足的贴壁时间，过早搬动则会导致细胞不能贴壁而使培养失败；

继代培养的细胞贴壁相对较快，肿瘤细胞更快，在接种的24小时内基本上已能贴壁。

有些组织来源的细胞在玻璃或常规聚合材料制成的培养瓶中较难贴壁，须在瓶壁上附一层基质如鼠尾胶原等[8，9]，这样更能保证培养细胞的功能接近于体内。

三、细胞的传代

当细胞培养达到85%~95%汇合时，即可进行传代培养，用胰酶或EDTA将细胞进行消化（有些贴壁不紧的肿瘤细胞如HEK-293细胞等只需轻轻吹打而不需消化就能将细胞分散[10]），使细胞回缩呈透亮的圆形，加入冷的Hank液终止消化，离心收集细胞，按1:

2至1:

4将细胞分成等份继代培养。

四、培养细胞的检测

各种细胞既具有相同的特性，又有其独有的特性。

本节所介绍的是各种细胞共有特性的检测。

（一）细胞形态学观察生长状态良好的细胞，镜下可见细胞透亮、轮廓欠清，胞内无异常颗粒，原代正常组织细胞常呈规律排列，而肿瘤细胞排列比较杂乱。

细胞功能不良时，透光性下降，轮廓增强，胞内常出现不透明的异常颗粒及空泡、脂滴等，细胞被微生物污染时，培养基变浑浊或瓶内出现异常生长物，细胞形态发生改变，生长缓慢甚至脱落，镜下亦可见有异常活动的微生物出现。

同时还可将培养液取出少许涂片，乙醇固定，Giemosa染色后油镜下观察微生物形态。

如怀疑有衣原体或支原体污染，可用低张处理的嗜伊红染色观察。

图1-14-1细胞分裂指数和细胞数量的关系

（二）细胞增殖计数将消化后的细胞接种24孔板，分7组，每组3孔，培养一周。

每天取出一组细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用计数盘或细胞自动计数器计数，取3孔的平均值直至第7组结束，用座标图纸绘制成生长曲线，如图1-14-1。

（三）有丝分裂指数（mitoticindex:

MI）是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂细胞/1000），用以表示细胞增殖旺盛程度[11]。

因此在检测中需观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂相数，即细胞分裂指数=×

100。

具体方法是在培养瓶中加无菌洗净的盖玻片，每日从瓶中抽出盖玻片进行固定、染色（对于悬浮培养的细胞，则取一滴细胞悬液滴片后固定），制成永久性标本。

镜下观察分裂相并计数。

取得逐日分裂相计数后，可绘成细胞分裂指数曲线，如图1-14-1。

（四）流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成当细胞培养至80%左右汇合时，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测出细胞所处的周期相（G1、G2、S、M期）和DNA合成的周峰期，同时可测RNA含量[4]。

（五）细胞内总蛋白含量测定将细胞用TritonX100-Tris缓冲液裂解，离心后取上清，用Bradford方法测上清液中蛋白质浓度，测定时用牛血清白蛋白作为标准，标准液与待测样品均用考马斯亮兰G-250染色，在紫外分光光度计590nm波长处测出它们的吸光度。

根据不同蛋白浓度的标准液所对应的吸光值，分光光度计可自动得出所测样品的蛋白质浓度。

五、细胞株的建立

原代培养的正常细胞特别是内分泌细胞，其增殖的能力有限甚至有的根本不能传代。

因而必须将它们变成永生性细胞，以利于进一步的研究，但同时要设法保留原有细胞的大部分功能特性。

常用的方法为人工诱变，即用射线、温度、药物、病毒和化学致突物诱导细胞突变[11]。

其中以病毒和化学致突物常用（所用病毒一般为基因缺陷型病毒，它们丧失了在体外感染人和动物的能力；

化学致突物常为强烈致癌剂，使用时一定要加强防护），如用EB病毒可转化正常人外周血淋巴细胞，腺病毒可转化肾小管上皮细胞。

大部分细胞株的建立是直接取肿瘤组织进行分离培养，肿瘤细胞虽然为低分化细胞，但同时也具有部分分化细胞的特性，因而在研究分化细胞的某一方面的特性时，常可用某一类似的细胞株来代替，目前在内分泌方面常用的细胞株如表1-14-2。

表1-14-2内分泌常用细胞系

分类

组织来源

特性

MG-63

成骨肉瘤细胞系

14岁女性成骨

肉瘤

多倍体细胞株,能产生大量

胶原,能分泌ALP,具有

体外矿化能力

Saos-2

人

能分泌大量ALP、合成胶

原能力不及MG-63

ROS17/2.8

大鼠

MC3T3-E1

成骨样细胞系

小鼠颅骨转化

细胞株

UMR106

前成骨样细胞系

MBA-1

骨髓基质细胞系

可分泌Ⅰ，Ⅲ型胶原，可

体外培养成骨

INS-1

胰岛B细胞系

鼠

能对生理状态下的葡萄糖

刺激产生反应，并分泌

胰岛素

NES2Y

胰岛素分泌细胞株

持久性高胰岛

素血症的病

人

缺乏机能敏感性的钾通

道，胰岛素基因调节转

录因子PDXI缺乏

HIT-T15

胰腺B细胞系

MIN6

NPA

甲状腺乳头状癌细胞系

人低分化甲状

腺乳头状癌

TT

甲状腺髓样癌细胞系

WRO

甲状腺滤泡状癌细胞株

ARO/FRO

甲状腺癌细胞系

未分化甲状腺

乳头状癌

CHO-K1

卵巢细胞系

中国仓鼠

ST

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