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1、常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。实际应用时，应针对不同的组织来源，采用不同的类型和酶浓度。经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。（一）筛网过滤法 选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌的筛网过滤，孔径比细胞大的物质便留在筛网上。该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块如除去包膜的脾脏细胞等是有效的，而对于其他细胞如胰岛等则需进一步的纯化。（二）密度梯度离心 使用不同浓度的Ficoll（含葡聚糖）形成不同的密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当

2、离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞1。经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。（三）显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层 为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大（如胰岛）或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的2。（四）选择性培养 在培养基中加入非目的细胞的特异性抑制物，使得非目的细胞不能增殖并诱发其凋亡，从而使细胞达到纯化3。该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。（五）流式细胞技术 将细胞荧光染色（对细胞无毒，仍可存活）后，在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50100m的小孔

3、并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离4。（六）共聚焦激光扫描显微镜技术 利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆粘附细胞。二、离体细胞的培养（一）培养液 由基本培养基及补充物所组成，对来源于体液的细胞如外周血淋巴细胞而言，选用RPMI1640培养液较好。对贴壁培养的细胞，可选用DMEM、MEM、F12、M

4、cCoyS 5A, F10或DMEM/F12混合物。其中F12、F10较常用于成纤维细胞的培养，DMEM、MEM、McCoyS 5A较常用于上皮细胞的培养。同一类型的基本培养基其组成成份不同，有高糖型、低糖型，有些含有酚红。对于高糖需要型细胞如胰岛培养，则选用高糖型培养液。而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法如表1-14-1。表1-14-1 生长因子及激素的配制和使用溶剂贮存浓度贮存温度（）使用

5、浓度L-抗坏血酸PBS50mg/ml425g/ml100g/ml上皮生长因子（EGF）H2O2g/ml-201ng/ml成纤维细胞生长因子5ng/ml丙酮酸钠100mM1mM氢化可的松95%乙醇210-4M10-6M地塞米松10-5M10-7-10-8M雌激素10-3M10-8M维生素A酸胰岛素0.01N HCl1mg/ml5g/ml动物血清常用5%15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中的各种生长因子、激素及免疫球蛋白等吸附去除（炭吸附血清，CS-FBS），以满足细胞培养中的特殊需要5。我们用0.1%BSA（牛血清白蛋白）代替CS-FBS用于肿瘤细胞的培养，效果良好6。同

6、时Sigma公司有去除不同细胞因子和激素的血清替代物出售（serum replacement），它们亦能满足特殊培养中的部分需要。（二）培养介质 除血液、脾脏、胸腺等来源的细胞外，哺乳动物细胞的培养一般采用贴壁培养。将分离后的细胞加入适量培养液（占培养空间的5%20%，V/V），置于37、5%CO2、95%空气及保和湿度下培养，而昆虫细胞如Sf9细胞则不能耐受37的高温7，最适培养温度为27。原代贴壁培养的细胞在培养的前23天保持不动，以保证细胞有充足的贴壁时间，过早搬动则会导致细胞不能贴壁而使培养失败；继代培养的细胞贴壁相对较快，肿瘤细胞更快，在接种的24小时内基本上已能贴壁。有些组织来源的

7、细胞在玻璃或常规聚合材料制成的培养瓶中较难贴壁，须在瓶壁上附一层基质如鼠尾胶原等8，9，这样更能保证培养细胞的功能接近于体内。三、细胞的传代当细胞培养达到85%95%汇合时，即可进行传代培养，用胰酶或EDTA将细胞进行消化（有些贴壁不紧的肿瘤细胞如HEK-293细胞等只需轻轻吹打而不需消化就能将细胞分散10），使细胞回缩呈透亮的圆形，加入冷的Hank液终止消化，离心收集细胞，按1:2至1:4将细胞分成等份继代培养。四、培养细胞的检测各种细胞既具有相同的特性，又有其独有的特性。本节所介绍的是各种细胞共有特性的检测。（一）细胞形态学观察 生长状态良好的细胞，镜下可见细胞透亮、轮廓欠清，胞内无异常颗

8、粒，原代正常组织细胞常呈规律排列，而肿瘤细胞排列比较杂乱。细胞功能不良时，透光性下降，轮廓增强，胞内常出现不透明的异常颗粒及空泡、脂滴等，细胞被微生物污染时，培养基变浑浊或瓶内出现异常生长物，细胞形态发生改变，生长缓慢甚至脱落，镜下亦可见有异常活动的微生物出现。同时还可将培养液取出少许涂片，乙醇固定，Giemosa染色后油镜下观察微生物形态。如怀疑有衣原体或支原体污染，可用低张处理的嗜伊红染色观察。图1-14-1 细胞分裂指数和细胞数量的关系（二）细胞增殖计数 将消化后的细胞接种24孔板，分7组，每组3孔，培养一周。每天取出一组细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用计数盘或细胞自动计数器计数，取3孔

9、的平均值直至第7组结束，用座标图纸绘制成生长曲线，如图1-14-1。（三）有丝分裂指数（mitotic index: MI） 是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂细胞/1000），用以表示细胞增殖旺盛程度11。因此在检测中需观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂相数，即细胞分裂指数=100。具体方法是在培养瓶中加无菌洗净的盖玻片，每日从瓶中抽出盖玻片进行固定、染色（对于悬浮培养的细胞，则取一滴细胞悬液滴片后固定），制成永久性标本。镜下观察分裂相并计数。取得逐日分裂相计数后，可绘成细胞分裂指数曲线，如图1-14-1。（四）流式细胞仪检测细胞周期时相和DNA合成 当细胞培养至80

10、%左右汇合时，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测出细胞所处的周期相（G1、G2、S、M期）和DNA合成的周峰期，同时可测RNA含量4。（五）细胞内总蛋白含量测定 将细胞用Triton X100-Tris缓冲液裂解，离心后取上清，用Bradford方法测上清液中蛋白质浓度，测定时用牛血清白蛋白作为标准，标准液与待测样品均用考马斯亮兰G-250染色，在紫外分光光度计590nm波长处测出它们的吸光度。根据不同蛋白浓度的标准液所对应的吸光值，分光光度计可自动得出所测样品的蛋白质浓度。五、细胞株的建立原代培养的正常细胞特别是内分泌细胞，其增殖的能力有限甚至有的根本不能传代。因而必须将它们变成

11、永生性细胞，以利于进一步的研究，但同时要设法保留原有细胞的大部分功能特性。常用的方法为人工诱变，即用射线、温度、药物、病毒和化学致突物诱导细胞突变11。其中以病毒和化学致突物常用（所用病毒一般为基因缺陷型病毒，它们丧失了在体外感染人和动物的能力；化学致突物常为强烈致癌剂，使用时一定要加强防护），如用EB病毒可转化正常人外周血淋巴细胞，腺病毒可转化肾小管上皮细胞。大部分细胞株的建立是直接取肿瘤组织进行分离培养，肿瘤细胞虽然为低分化细胞，但同时也具有部分分化细胞的特性，因而在研究分化细胞的某一方面的特性时，常可用某一类似的细胞株来代替，目前在内分泌方面常用的细胞株如表1-14-2。表1-14-2

12、内分泌常用细胞系分类组织来源特性MG-63成骨肉瘤细胞系14岁女性成骨 肉瘤多倍体细胞株,能产生大量 胶原,能分泌ALP,具有 体外矿化能力Saos-2人能分泌大量ALP、合成胶 原能力不及MG-63ROS17/2.8大鼠MC3T3-E1成骨样细胞系小鼠颅骨转化 细胞株UMR106前成骨样细胞系MBA-1骨髓基质细胞系可分泌，型胶原，可 体外培养成骨INS-1胰岛B细胞系鼠能对生理状态下的葡萄糖 刺激产生反应，并分泌 胰岛素NES2Y胰岛素分泌细胞株持久性高胰岛 素血症的病 人缺乏机能敏感性的钾通 道，胰岛素基因调节转 录因子PDXI 缺乏HIT-T15胰腺B细胞系MIN6NPA甲状腺乳头状癌

13、细胞系人低分化甲状 腺乳头状癌TT甲状腺髓样癌细胞系WRO甲状腺滤泡状癌细胞株ARO/FRO甲状腺癌细胞系未分化甲状腺 乳头状癌CHO-K1卵巢细胞系中国仓鼠ST在判断EA和EP值的过程中，所参照的方法和数据不同，往往得出的结果和结论也存在差异，品牌经理的职责是通过分析，判别干扰因素，下面以如何判定产品P的需求价格弹性来举例说明，OTC产品的销售表现往往以三个销售数据来衡量：商业销售数据，目标药店销售数据和目标医院销售数据，产品P为2001年才进入OTC目录的药品，在此以前，销售业绩主要来自医院，以2001年上半年的销售表现为例：商业销售3千6百万，其中60，即2千1百万来自目标医院，20即7百万来自目标药店，产品P于2001年5月涨价，由原来的每支RMB19.65涨到每支RMB22.65，我们可以通过衡量2001