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多糖；

分离纯化；

抗氧化

中图分类号：

Q949．2文献标识码：

A

随着陆地资源的逐渐枯竭，人们逐渐将研究

方向转向海洋，从海洋生物中寻求新的天然抗氧

化剂、新的抗衰老药物等已成为医药、食品等领域

的重要目标．叉鞭金藻（Dicrateriasp．）是一种经

济价值较高的海洋单细胞微藻，广泛用于虾、贻

贝、牡蛎等多种海珍品的人工养殖¨

．目前对叉

鞭金藻的研究主要集中在：

（1）高密度培养的研

究，以生物量形式作为饵料的应用；

（2）用作污水

处理中的cu¨

、Pb等有害金属离子的生物吸附

剂；

（3）有机磷农药对其生长繁殖抑制机制的研

究，从而进一步研究海洋微藻的致毒性J．此外

对于叉鞭金藻活性物质的研究中对其合成不饱和

脂肪酸的研究较多，而对于其多糖研究的报道很

少，多数仅停留在多糖含量的测定上．本文从叉鞭

金藻多糖的提取纯化人手，获得不同组分的多糖

并对其体外抗氧化作用进行研究，以期为叉鞭金

藻多糖作为食品添加剂或海洋药物的开发提供一

定的参考．

1材料与方法

1．1材料与仪器

叉鞭金藻（Dicrateriasp．）原种购于中国海洋

大学种质库，实验用藻种由烟台大学海洋生化研

究所纯化并保存．

药品：

邻苯三酚，国药集团化学试剂有限公

司；

邻二氮菲，天津市大茂化学试剂厂；

三羟甲基

氨基甲烷（Tris），Sanland—ehemInternationalInc；

HO，天津市大茂化学试剂厂；

七水和硫酸亚铁，

烟台三和化学试剂有限公司；

硫代巴比妥酸

（TBA），上海试剂二厂．以上试剂均为分析纯．

清洁级昆明种小鼠，雄性，体重20～22g，山

东绿叶制药有限公司（许可证号：

SYXK（鲁）

20030020）．

主要仪器：

UV1601紫外可见分光光度计，日

本SHIMAZU公司产品；

BSZ一100自动部分收集

器，上海沪西分析仪器厂；

HL一2S恒流泵，上海沪

收稿日期：

2009-07—13

资助项目：

山东省自然科学基金资助项目（Y2007D59）；

烟台大学大学生科技创新基金资助项目（080605）．

作者简介：

周妍（1985一），女，山东东营人，硕士研究生，研究方向：

海洋活性物质；

通讯联系人：

王长海（chwang2001

@sina．tom），教授，博士生导师．

290烟台大学学报（自然科学与工程版）第23卷

西分析仪器厂；

Agilent1100型高效液相色谱仪，

美国安捷伦科技有限公司．

1．2方法

1．2．1叉鞭金藻粗多糖的制备新鲜培养的叉

鞭金藻藻液经离心后，加入5倍体积的去离子水，

置于一4℃冷冻，然后取出融化，如此反复3次获

得水溶性提取物；

将冻融后的溶液超声破碎，离心

10rain，取上清液在水浴中加热，浓缩至原体积的

1／3，加人体积分数为3％的三氯乙酸沉淀蛋白，

12000r／min离心10rain，取上清液；

加入5倍体

积的95％乙醇，离心取沉淀洗涤、透析、冷冻干燥

得白色粉末为粗多糖DAPL3J．

1．2．2粗多糖的分级与纯化将叉鞭金藻粗多

糖DAP配成5mg／mL的水溶液，上平衡好的

Sepharose6B琼脂糖凝胶层析柱（3．5cm×

80

era）．用0．O1mol／L的NaC1溶液梯度洗脱，流速

0．6mL／min，按管收集，用硫葸酮法于620nm

处检测糖的吸光度，得到多糖的洗脱曲线．根据洗

脱曲线分段收集，合并相同组分，浓缩，加人5倍

体积的95％乙醇使其完全沉淀，离心收集沉淀，

加蒸馏水，透析脱盐，冷冻干燥即得多糖精品．

1．2．3多糖纯度和分子量检测将DAP制成

0．2％的溶液，经0．22m滤膜过滤后，取滤液20

注入液相色谱仪，色谱柱为TSKGel一4000Pw

凝胶色谱柱（10m，7．5mm×

300mm），流动相

为双蒸水，流速为0．5mL／min，示差检测器温度

为35℃，分析时间为40rain．记录色谱图，并根据

标准单糖测定的普适标准曲线计算DAP分子质

量

1．2．4抗氧化活性的检测

（1）羟自由基（OH·

）清除实验．取0．75

moL／L邻二氮菲溶液1mL于试管中，加入400

mmoL／LPBS（pH7．4）缓冲液2mL和蒸馏水1

mL，充分混匀后，加2．5mmoL／L硫酸亚铁溶液1

mL，混匀，加20mmoL／LH2O21mL，于37℃水浴

1．5h，在536nm处测其吸光度，记做A；

用1mL

蒸馏水代替1mLH：

0，测得的吸光度记做A；

用

DAP1mL代替1mL蒸馏水，测得的吸光度记做

A_4J．按下式计算OH·

自由基清除率：

A．

（2）超氧阴离子（O·

）清除实验．各管分别

加入0．05moL／LTris—HC1（pH8．2）缓冲液4．6

mL，加入1mL多糖溶液，混匀后在25℃水浴保

温10rain，取出后立即加入在25℃预热过的

0．06moL／L邻苯三酚溶液0．3mL（对照管加入

10mmol／1HC10．3mE）．各管充分混匀，准确反应

3rain（加入邻苯三酚时开始计时）后加入5％Vc

0．1mL终止反应．10min后，在420llm处测定吸

光度，记做A；

对照管以1mL蒸馏水代替待测样

品，记做A：

l5J．按下式计算0·

清除率：

A——A

（3）多糖对H0：

诱发小鼠红细胞氧化溶血

的影响．昆明小鼠眼球取血，肝素抗凝，2000r／

min离心6min，弃血浆，所剩红细胞用4倍量生

理盐水洗涤及同法离心，洗3次后用生理盐水悬

浮，调红细胞体积分数为0．5％．取红细胞悬浮液

1mL，加人100mmol／LH20：

（空白管不加H202）

及多糖溶液1mL，37oC温育1h，加入4倍量生理

盐水稀释，3000r／min离心6min，上清液于415

nm处测吸光度]．溶血按下式计算抑制率，用线

性回归求算Ic

（4）多糖对小鼠肝匀浆脂质过氧化作用的测

定．小鼠眼球取血后，迅速分离肝组织，将肝组织

用冰冷的Tris—HC1缓冲液（20mmol／L）经研磨棒

制备成20％的肝匀浆．使反应体系中含肝匀浆液

0．2mL，FeSO的终浓度为）l0I~mol／L，Vc的终浓

度为0．1mmol／L，及不同浓度的多糖，在37℃温

浴1h，保温结束后加入20％三氯乙酸（TCA）1．0

mL终止反应，混匀，再加入0．67％硫代巴比妥酸

（TBA）1．5mL，沸水浴加热15rain．离心去除蛋白

质沉淀后，于532nm测定吸光度（以Tris～HC1

缓冲液为空白），按下式计算抑制率：

1．2．5数据处理实验结果以均值4-标准差表

示．采用t检验对实验结果进行分析，P<

0．05表

示差异显著，P<

0．O1表示差异极显著．

2结果与分析

2．1多糖洗脱级分及洗脱曲线

本实验收集到2个分级产物，分别命名为

第4期周妍，等：

叉鞭金藻多糖的分离纯化及体外抗氧化作用研究291

DAP一1和DAP一2．由图1可见，2种组分的多糖

的洗脱曲线均为窄、锐且形状对称的单峰，表明2

种组分多糖的分子质量范围区间均较小，可看作

均一组分多糖．

图1叉鞭金藻多糖的洗脱曲线

Fig．1ElutioncurveofpolysaccharidefromDicrateriasp．

2．2多糖纯度和分子量测定结果

从图2、3可以看出，DAP一1和DAP一2在

HPLC中均呈现为单一对称尖峰，表明二者均为

均一多糖组分．根据标准曲线可得DAP一1和

DAP一2的平均均分子质量分别为1．86×

10。

和

6．9×

10．

2．3DAP对羟自由基（OH·

）的清除作用

将多糖溶液经稀释后依次得到6个浓度梯度

的样品（2．0，1．0，0．5，0．25，0．125，0．0625mg／

mL），以考察其对羟自由基（OH·

）的清除作用．

结果表明低浓度时（终浓度小于0．02mg／mL）

DAP一1和DAP一2对羟自由基的清除作用较差，

随着浓度的增加，对OH·

的消除作用逐渐增强，

半数抑制率Ic∞分别为0．102、0．059mmL．经t

检验结果分析可得，终浓度高于0．02mg／mL，

DAP一2对OH·

的清除作用与DAP一1相比有显

著性（P<

0．05）或极显著性差异（一P<

0．．01），

表明DAP-2对羟自由基（OH·

）的清除作用明显

高于DAP一1．

图2DAP一1的高效液相色谱图

Fig．2High—performanceliquidchromatographyofDAP一1

2．4DAP对超氧阴离子（O·

从图5可知，不同浓度的DAP一1和DAP一2

对超氧阴离子（O·

）均有较好的清除作用（一

P<

0．01），且随浓度增大，对O·

的清除率也

呈上升趋势，在终浓度为0．167mg／mL，清除率分

别达到67．5％和74．4％，高于此浓度，清除率趋

于定值稳定．经t检验分析，各浓度组（终浓度为

0．04mg／mL除外）DAP一2对超氧阴离子（O

·

）的清除率均显著或极显著高于DAP一1（