MMI激光显微切割与单细胞操作系统及应用Word下载.docx
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因此用一群细胞作为起始样本分析,不能准确反映每个单细胞的真实情况,往往会因为细胞的异质性而得不到真实的结果。
有些情况下我们必须以单细胞为起始样本进行试验,如在进行试管婴儿的受精卵植入前诊断时,在受精卵分裂到8个细胞时取其中一个细胞进行多个遗传指标的诊断,这时我们只能使用一个细胞进行试验。
目前很多科学家都开始关注单细胞研究,因为单细胞中同样包含了一个物种全部的遗传基因,这样一个细胞就可以代表一个物种,而且很多事情的发生都是以一个细胞为起始的,如胚胎的发育,肿瘤的形成等。
而且,以单细胞为起始样本进行试验还可以避免多细胞研究时多个不同类型细胞研究之间相互干扰造成试验偏差。
在肿瘤研究领域,生殖研究领域,微生物研究领域,再生生物学和干细胞领域,以及在法医学领域,以单细胞为起始样本显的更加有意义。
为了克服这些困难,研究者开发了很多手工或自动的方法来获取特定的单一类型纯净样本。
在这些方法中,激光显微切割（LaserMicrodissection,LMD由于其操作简单,实验快速准确,收集的样本质量可靠而被广泛运用。
激光显微切割技术是近年来发展起来的样本微分离技术,它把高精度的紫外激光与倒置显微镜相整合,在显微镜下观察待分离的样本,通过紫外激光把目标部分切割分离下来。
它可作为日常收集纯净靶细胞以用于后续DNA、RNA和蛋白研究的工具,是连接形态学与分子生物学研究的桥梁。
激光显微切割技术（LMD已经在肿瘤研究,心血管疾病研究,基因组学,蛋白组学以及细胞生物学等众多领域被广泛运用,它拓宽了基因组学研究的领域和精度,更为分子肿瘤学的发展提供了不可替代的帮助,已日渐成为不可替代的支柱技术之一。
举个例子来说（图1,在对乳腺癌样本的基因表达情况进行研究时,如果采用一般的病变组织块匀浆处理后抽提的RNA进行杂交,结果会发现Proteoglycan1和CD53antigen基因表达量较高,Proteosomesubunit基因相对较低。
但在癌变的细胞中,真实的情况是不是这样的呢?
我们采用显微切割技术,将癌变细胞特异地切割下来,再使用同样的后续处理方法进行研究就可以发现,在单纯的癌变细胞中,Proteosomesubunit基因的表达量远远高于Proteoglycan1和CD53antigen基因。
是什么原因导致两次分析的结果差别如此巨大呢?
简单分析后不难发现,问题之所在是:
最初的实验使用的是混合样本!
由于正常细胞中Proteoglycan1和CD53antigen属于表达量很高的基因,而Proteosomesubunit基因表达量相对要低很多,因此使用混合的组织样本就导致了癌变细胞中的真实基因表达情况淹没在正常细胞的背景信号中,很难发现癌变细胞中真实的基因表达情况。
这时候,使用显微切割技术,从混合的组织样本中将需要研究的细胞特异的分离出来,就可能发现以往使用混合样本无法发现的肿瘤表达标签。
在众多激光显微切割生产厂家中,瑞士的MMI（MolrcularMachines&
Industries公司是近年来发展最快的显微切割厂家。
MMI是专门致力于将高精度的激光技术应用于生命科学领域的一家专业公司。
目前已经开发
图1.激光显微切割技术与普通方法对乳腺癌样本基因表达的对比结果分析
出众多尖端产品,包括激光显微切割系统（CellCutPlus和SmartCutPlus、显微细胞挑选系统（CellEctorPlus和激光显微操作系统（CellManipulatorPlus。
同时MMI采用模块化设计,上述三个系统之间可实现相互兼容,升级,可配荧光模块,和共聚焦显微镜、拉曼光谱仪、以及全内反射荧光纤维镜整合,可为用户提供对单细胞或单一类型样本分离操作及相互作用分析的完整解决方案。
其开发的CellCutPlus全自动高精度显微切割系统（图2,结合了膜黏附分离的安全性,以及固态紫外激光（高频低能切割的高精度两方面优点,为显微切割提供了更便捷更精确的操作平台。
其一,整个流程包括样品成像、目标选择、显微切割、切割前后结果照片的拍摄（图3,样本收集都实现了高度自动化,其激光聚焦,更换视野及载物台移动,更换物镜后的CCD参数设置转换等完全由软件控制,点击鼠标即可完成,快速简捷;
其荧光模块还可对荧光标记的样本进行切割分离。
其二,新的软件基于Windows7系统,用户界面简洁,直观,功能更强大,操作更灵活,便捷。
软件通过精确的激光参数设置对靶目标的选择方式也非常方便灵活:
可以先对整张样片进行快速扫描以便迅速确定目标区域;
提供多种绘图工
具甚至可选用触摸屏配套笔直接在触摸屏上勾画,而且还可以绘制大于视野的目标样本;
还有分组切割功能,可一次性选择多组细胞,并自动计算出每组的总选择面积。
甚至还可以通过软件进行染色样本的切割分离,同时Z-Drill功能可以在不需要增大激光能量的情况下对较厚或者较湿的样本进行螺旋切割,确保在不损伤样本的状态下对其进行有效切割;
软件还可自动对粘性分离管盖进行分区,将管盖分为多达300个有效粘附位置（PTP,PositiveTargetPositioning,将分步或分组切割的样本收集在不同的分区,确保每次切割的样本都能有效收集;
甚至在一些细节上,这套系统也考虑得很周到,如三明治结构的样片,样品被很好地保护在托片膜和载玻片之间,免受外界污染,在整个分离过程中,激光都不与需要分离的样本接触,对样本损伤小,从而保证了样本RNA的完整性,为样本RNA水平的研究提供保障;
其三,由于高精度激光器（40倍物镜下激光直径小于1μm和高精度电动载物台（步移距离高达0.025μm的配套,可进行高精度的显微切割,甚至是特定染色体的显微切割;
用配套的培养皿还可进行培养细胞的显微分离,分离得到的样本可以进行后续培养,这对于从一些肿瘤组织中分离出单一类型肿瘤细胞,避免其它生长旺盛的杂细胞对后续培养建系时的干扰有一定意义;
其四,适用的样本类型除了常见的石蜡切片,冰冻切片,陈旧组织切片,染色体的显微切割外,还包括活细胞涂片,进行活细胞的显微分离,避免污染,而且分离到的细胞可以继续培养而且生长不受任何影响,保证获得的活细胞的高成活率。
除了对上述样本进行显微甚至单细胞分离外,MMI公司最新开发的CellEctorPlus活细胞挑选系统（图4,在悬浮细胞或其它液体环境中用于挑选单细胞或者单一类型细胞。
该系统基于高性能全自动倒置显微镜,装配有高分辨率的数字CCD用于观察样品,并配合高精度XY-载物台、全自动毛细管持臂（其毛细管尖可实现两个方向收集样本和高精度的吸液泵。
通过CCD把动态细胞图像显示在电脑显示器上,通过观察细胞的大小、形态,荧光标记后荧光信号的有无或者荧光信号的强度或者信号的位置来选择靶细胞,可以通过软件自动识别并选择靶细胞,也可以通过人手动识别细胞,通过鼠标选择细胞,仪器自动完成挑选细胞并把细胞转移到指定的器皿中供后续试验。
相对于以前的全手动的挑选技术,CellEctorPlus从细胞识别,细胞挑选和细胞分配各方面能够实现完全自动化,提高了操作效率,同时采用毛细管和高精度的吸液泵,分辨率达2nl,有效控制滴油,气泡等的流速,还可加配第二个吸液泵,提高了细胞挑选的准确性。
而相对于流式细胞仪只能选择特定荧光标记的细胞,CellEctorPlus真正做到了“所见即所得”,不仅能够选择特定荧光标记的细胞,还可以根据细胞形态来选择细胞,还可以根据荧光信号在细胞内的位置来选择细胞。
并引进了单细胞扩增仪和单细胞试验的试剂和耗材,实现了单细胞检测的完整解决方案（比如PCR或者Realtime-PCR,为单细胞研究提供了完整的解决方案。
值得注意的的是CellEctorPlus现在还可以升级,与一些正置显微镜整合,兼容性更好。
图2.CellCutPlus激光显微切割系统
图3.CellCutPlus激光显微切割前后结果
分离前的切片分离后的切片
分离获得的目的细胞
激光显微操作系统（CellManipulatorPlus是一款专业的光镊（opticaltweezer产品（图5,可以对多达20个分子,细胞或其他微粒进行逐一、成组或同步操作。
其工作原理为:
激光通过显微镜物镜聚焦形成光斑,由于激光光子的力学效应,在焦点处形成三维梯度力光阱,该力学光阱可以捕获光斑附近的生物微粒,进而对其进行操控。
该系统采用波长为1064nm的新的8W高功率光纤耦合红外激光器,具有纳米级的分辨率及最高的800PN的维梯度力光阱力,可以进行精确的非接触式操控,对样品无损伤,对微环境无影响;
可捕获并操控大小范围为20μm-200μm的细胞或微粒,拥有可选的两层光镊,在Z水平上独立、灵活捕获多达2X10个细胞或微粒。
其微粒位置检测器（MBPS-Multibeadpositioningdetector上附加光学变焦系统可将微粒放大13倍,4-QD（4-quadrantdetector系统可精确测量样本间的相互作用力或者样本自身动力。
可用于不同的领域:
如细胞与细胞之间的相互作用,分选单细胞或某一类细胞;
结合力或粘度测定,如可将DNA拉伸或扭曲以研究其物理特性;
在分子马达进行研究中,如Actin/myosin蛋白之间的相互作用,细胞融合,胶体与界面化学等。
转化或转换医学（TranslationalMedicine是近两三年来国际医学健康领域出现的新概念,有效地打破了基础研究与临床医学之间的屏障,缩短了从基础研究到临床应
用的时间,转化医学强调以临床为中心,从临床工作中发现和提出问题,将基础研究最新成果快速有效地转化为临床医学技术。
MMI公司的激光显微切割系统正是在临床水平上同转化医学有效地结合起来,在肿瘤研究领域,干细胞研究,生殖生物学,微生物学,法医领域,血液学,病毒学,生物医学,细胞诊断的研究领域也有了广泛的推广和应用。
在这里我们对激光显微切割的转化医学方面的应用举一些例子进行介绍。
一、激光显微切割系统在心脏细胞病毒感染检测中的运用
近年来,有研究者使用激光显微切割从感染EB病毒（Epstein-Barrvirus的心脏内膜组织切片中准确快速分离心肌细胞和侵入的淋巴细胞。
EBV偶尔会被在心肌炎病人心肌组织中被检测到,但是关于病
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