MMI激光显微切割与单细胞操作系统及应用Word下载.docx

1、因此用一群细胞作为起始 样本分析,不能准确反映每个单细胞的真实情况,往往 会因为细胞的异质性而得不到真实的结果。有些情况下 我们必须以单细胞为起始样本进行试验,如在进行试管 婴儿的受精卵植入前诊断时,在受精卵分裂到 8个细胞 时取其中一个细胞进行多个遗传指标的诊断,这时我们 只能使用一个细胞进行试验。目前很多科学家都开始关 注单细胞研究,因为单细胞中同样包含了一个物种全部 的遗传基因,这样一个细胞就可以代表一个物种,而且 很多事情的发生都是以一个细胞为起始的,如胚胎的发 育,肿瘤的形成等。而且,以单细胞为起始样本进行试 验还可以避免多细胞研究时多个不同类型细胞研究之间 相互干扰造成试验偏差。在

2、肿瘤研究领域,生殖研究领 域,微生物研究领域,再生生物学和干细胞领域,以及 在法医学领域,以单细胞为起始样本显的更加有意义。 为了克服这些困难,研究者开发了很多手工或自 动的方法来获取特定的单一类型纯净样本。在这些方法 中,激光显微切割（Laser Microdissection, LMD由于 其操作简单,实验快速准确,收集的样本质量可靠而被 广泛运用。激光显微切割技术是近年来发展起来的样本 微分离技术,它把高精度的紫外激光与倒置显微镜相整 合,在显微镜下观察待分离的样本,通过紫外激光把目 标部分切割分离下来。它可作为日常收集纯净靶细胞以用 于后续 DNA 、 RNA 和蛋白研究的工具,是连接

3、形态学与 分子生物学研究的桥梁。激光显微切割技术（LMD 已 经在肿瘤研究,心血管疾病研究,基因组学,蛋白组学以 及细胞生物学等众多领域被广泛运用,它拓宽了基因组学 研究的领域和精度,更为分子肿瘤学的发展提供了不可替 代的帮助,已日渐成为不可替代的支柱技术之一。举个例子来说（图 1,在对乳腺癌样本的基因表达 情况进行研究时,如果采用一般的病变组织块匀浆处理后 抽提的 RNA 进行杂交,结果会发现 Proteoglycan 1和 CD53 antigen 基因表达量较高, Proteosome subunit基因相对较 低。但在癌变的细胞中,真实的情况是不是这样的呢? 我们采用显微切割技术,将癌

4、变细胞特异地切割下来,再 使用同样的后续处理方法进行研究就可以发现,在单纯 的癌变细胞中, Proteosome subunit基因的表达量远远高于 Proteoglycan 1和 CD53 antigen基因。是什么原因导致两次 分析的结果差别如此巨大呢?简单分析后不难发现,问题 之所在是:最初的实验使用的是混合样本!由于正常细胞 中 Proteoglycan 1和 CD53 antigen属于表达量很高的基因, 而 Proteosome subunit基因表达量相对要低很多,因此使用 混合的组织样本就导致了癌变细胞中的真实基因表达情况 淹没在正常细胞的背景信号中,很难发现癌变细胞中真实 的

5、基因表达情况。这时候,使用显微切割技术,从混合的 组织样本中将需要研究的细胞特异的分离出来,就可能发 现以往使用混合样本无法发现的肿瘤表达标签。在 众 多 激 光 显 微 切 割 生 产 厂 家 中 , 瑞 士 的 M M I （Molrcular Machines & Industries公司是近年来发展最 快的显微切割厂家。 MMI 是专门致力于将高精度的激光 技术应用于生命科学领域的一家专业公司。目前已经开发 图1. 激光显微切割技术与普通方法对乳腺癌样本基因表达的对比结果分析出众多尖端产品,包括激光显微切割系统（CellCut Plus和 SmartCut Plus、显微细胞挑选系统（

6、CellEctor Plus 和激光显微操作系统（CellManipulator Plus。同时 MMI 采用模块化设计,上述三个系统之间可实现相互兼容,升 级,可配荧光模块,和共聚焦显微镜、拉曼光谱仪、以及 全内反射荧光纤维镜整合,可为用户提供对单细胞或单一 类型样本分离操作及相互作用分析的完整解决方案。 其开发的 CellCut Plus 全自动高精度显微切割系统 （图 2,结合了膜黏附分离的安全性,以及固态紫外激 光（高频低能切割的高精度两方面优点,为显微切割提 供了更便捷更精确的操作平台。其一,整个流程包括样品 成像、目标选择、显微切割、切割前后结果照片的拍摄 （图 3,样本收集都实现

7、了高度自动化,其激光聚焦, 更换视野及载物台移动,更换物镜后的 CCD 参数设置转 换等完全由软件控制,点击鼠标即可完成,快速简捷;其 荧光模块还可对荧光标记的样本进行切割分离。其二,新 的软件基于 Windows 7系统,用户界面简洁, 直观,功能 更强大,操作更灵活,便捷。软件通过精确的激光参数设 置对靶目标的选择方式也非常方便灵活:可以先对整张样 片进行快速扫描以便迅速确定目标区域;提供多种绘图工具甚至可选用触摸屏配套笔直接在触摸屏上勾画,而且还 可以绘制大于视野的目标样本;还有分组切割功能,可一 次性选择多组细胞,并自动计算出每组的总选择面积。甚 至还可以通过软件进行染色样本的切割分离

8、,同时 Z-Drill 功能可以在不需要增大激光能量的情况下对较厚或者较湿 的样本进行螺旋切割,确保在不损伤样本的状态下对其进 行有效切割;软件还可自动对粘性分离管盖进行分区, 将管盖分为多达 300个有效粘附位置 （PTP, Positive Target Positioning ,将分步或分组切割的样本收集在不同的分 区,确保每次切割的样本都能有效收集;甚至在一些细节 上,这套系统也考虑得很周到,如三明治结构的样片,样 品被很好地保护在托片膜和载玻片之间,免受外界污染, 在整个分离过程中,激光都不与需要分离的样本接触, 对样本损伤小,从而保证了样本 RNA 的完整性,为样本 RNA 水平的

9、研究提供保障;其三,由于高精度激光器（40倍物镜下激光直径小于 1m 和高精度电动载物台（步移 距离高达 0.025m 的配套,可进行高精度的显微切割, 甚至是特定染色体的显微切割;用配套的培养皿还可进行 培养细胞的显微分离,分离得到的样本可以进行后续培 养,这对于从一些肿瘤组织中分离出单一类型肿瘤细胞, 避免其它生长旺盛的杂细胞对后续培养建系时的干扰有一 定意义;其四,适用的样本类型除了常见的石蜡切片,冰 冻切片,陈旧组织切片,染色体的显微切割外,还包括活 细胞涂片,进行活细胞的显微分离,避免污染,而且分离 到的细胞可以继续培养而且生长不受任何影响,保证获得 的活细胞的高成活率。除 了对上述

10、样本进行显微甚至单细胞分离外, MMI 公司最新开发的 CellEctor Plus活细胞挑选系统（图 4, 在悬浮细胞或其它液体环境中用于挑选单细胞或者单一类 型细胞。该系统基于高性能全自动倒置显微镜,装配有高 分辨率的数字 CCD 用于观察样品,并配合高精度 XY-载物 台、全自动毛细管持臂（其毛细管尖可实现两个方向收集 样本和高精度的吸液泵。通过 CCD 把动态细胞图像显 示在电脑显示器上,通过观察细胞的大小、形态,荧光标 记后荧光信号的有无或者荧光信号的强度或者信号的位置 来选择靶细胞,可以通过软件自动识别并选择靶细胞,也 可以通过人手动识别细胞,通过鼠标选择细胞,仪器自动 完成挑选细

11、胞并把细胞转移到指定的器皿中供后续试验。 相对于以前的全手动的挑选技术, CellEctor Plus从细胞识 别,细胞挑选和细胞分配各方面能够实现完全自动化, 提高了操作效率,同时采用毛细管和高精度的吸液泵,分 辨率达 2nl,有效控制滴油,气泡等的流速,还可加配第二 个吸液泵,提高了细胞挑选的准确性。而相对于流式细胞 仪只能选择特定荧光标记的细胞, CellEctor Plus真正做到 了 “ 所见即所得 ” ,不仅能够选择特定荧光标记的细胞, 还可以根据细胞形态来选择细胞,还可以根据荧光信号在 细胞内的位置来选择细胞。并引进了单细胞扩增仪和单细 胞试验的试剂和耗材,实现了单细胞检测的完整

12、解决方案 （比如 PCR 或者 Realtime-PCR ,为单细胞研究提供了完 整的解决方案。值得注意的的是 CellEctor Plus现在还可以 升级,与一些正置显微镜整合,兼容性更好。图2. CellCut Plus激光显微切割系统图3. CellCut Plus激光显微切割前后结果分离前的切片 分离后的切片分离获得的目的细胞激光显微操作系统（CellManipulator Plus是一款专 业的光镊（optical tweezer产品（图 5,可以对多达 20个分子,细胞或其他微粒进行逐一、成组或同步操作。其 工作原理为:激光通过显微镜物镜聚焦形成光斑,由于 激光光子的力学效应,在焦

13、点处形成三维梯度力光阱, 该力学光阱可以捕获光斑附近的生物微粒,进而对其进行 操控。该系统采用波长为 1064nm 的新的 8W 高功率光纤耦 合红外激光器,具有纳米级的分辨率及最高的 800PN 的维 梯度力光阱力,可以进行精确的非接触式操控,对样品无 损伤,对微环境无影响;可捕获并操控大小范围为 20m-200m 的细胞或微粒,拥有可选的两层光镊,在 Z 水平上 独立、灵活捕获多达 2X10个细胞或微粒。其微粒位置检 测器（MBPS -Multibead positioning detector上附加光学变 焦系统可将微粒放大 13倍, 4-QD （4-quadrant detector系

14、 统可精确测量样本间的相互作用力或者样本自身动力。可 用于不同的领域:如细胞与细胞之间的相互作用,分选单 细胞或某一类细胞;结合力或粘度测定,如可将 DNA 拉 伸或扭曲以研究其物理特性;在分子马达进行研究中,如 Actin/myosin蛋白之间的相互作用,细胞融合,胶体与界 面化学等。转化或转换医学（Translational Medicine是近两三 年来国际医学健康领域出现的新概念,有效地打破了基础 研究与临床医学之间的屏障,缩短了从基础研究到临床应用的时间,转化医学强调以临床为中心,从临床工作中发 现和提出问题,将基础研究最新成果快速有效地转化为临 床医学技术。 MMI 公司的激光显微切割系统正是在临床水 平上同转化医学有效地结合起来,在肿瘤研究领域,干细 胞研究,生殖生物学,微生物学,法医领域,血液学,病 毒学,生物医学,细胞诊断的研究领域也有了广泛的推广 和应用。在这里我们对激光显微切割的转化医学方面的应用 举一些例子进行介绍。一、激光显微切割系统在心脏细胞病毒感染检测中 的运用近年来,有研究者使用激光显微切割从感染 EB 病毒 （Epstein-Barr virus的心脏内膜组织切片中准确快速分 离心肌细胞和侵入的淋巴细胞。 EBV 偶尔会被在心肌炎病 人心肌组织中被检测到,但是关于病