植物愈伤组织诱导培养实验指导Word格式.docx
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MS大量元素母液、MS微量元素母液、MS铁盐母液和MS有机化合物母液等。
另外，还要配制生长激素母液，在不同类型的培养基中使用。
3、实验仪器设备和试剂
3.1仪器、用具
分析天平、酸度计（或pH试纸）、冰箱、药匙、玻棒、称量纸、滴管、洗瓶、记号笔、烧杯（50ml、100ml、200ml）、容量瓶（100ml、500ml、1000ml）、磨口试剂瓶（100mL、200mL、500ml、1000ml）、量杯、量筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂
（1）95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。
（2）MS培养基成分：
①大量元素（母液Ⅰ）：
NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4；
②微量元素（母液Ⅱ）：
KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O；
③铁盐（母液Ⅲ）：
FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O；
④有机成分（母液,维生素和氨基酸）：
肌醇、盐酸吡哆醇（维生素B6）、烟酸（Vpp）、盐酸硫胺素（维生素B1）、甘氨酸；
（3）植物生长调节物质：
2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。
4、操作步骤
（1）MS大量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表1中的次序分别准确称量后，分别用50ml烧杯，加入蒸馏水30ml溶解（可以加热至60℃～70℃，促其溶解）。
溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水，目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250mL容量瓶定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。
表1MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量
母液
化合物名称
培养基用量（mg/L）
扩大倍数
称取量（mg）
母液体积（mL）
1L培养基吸取母液量（mL）
大量元素
KNO3
1,900
10
4,750
250
100
NH4NO3
1,650
4,125
MgSO4·
7H2O
370
9,25
KH2PO4
70
425
CaCl2·
2H2O
440
1,100
（2）微量元素母液的配制
按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍（表2），用万分之一天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。
表2MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量
微
量
元
素
MnSO4·
4H2O
22.3
223
ZnSO4·
8.6
86
H3BO3
6.2
62
KI
0.83
8.3
Na2MoO4·
0.25
2.5
CuSO4·
5H2O
0.025
10ml*
CoCl2·
6H2O
10ml**
*、**：
因天平均存在误差，为减少误差带来的影响，建议称取0.25g，溶解并定容至10ml容量瓶中，然后移取10ml，加入混合液中。
（3）铁盐母液的配制
常用的铁盐是FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。
配制时，按照扩大后的用量（表3），分别称取FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA，分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶中，贴好标签，注明母液名称、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。
表3MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量
铁盐
Na2-EDTA
37.3
373
FeSO4·
27.8
278
（4）有机物母液的配制
按照表4中各成分浓度扩大后的用量，用感量0.0001g天平分别称量各有机物。
可以分别溶解定容，分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。
一般有机物都溶于水，但叶酸（VBc）先用少量稀氨水或1mol/LNaOH溶液溶解；
VH（生物素）先用1mol/LNaOH溶液溶解；
VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。
表4MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量
有机物名称
培养基用量
（mg/L）
有
机
物
甘氨酸
2.0
20
VB1
0.4
4
VB6
0.5
5
烟酸
肌醇
1,000
（5）激素母液的配制
激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般是0.1～2mg/ml，根据需要确定配制的浓度。
称量激素要用感量为万分之一天平。
本实验选用激素2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。
2，4-D母液的配制方法为：
准确称取10mg2,4-D，称量后先用少量（1-3ml）95%乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即得到0.1mg/ml的2,4-D贮备液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人，置于4℃冰箱中保存备用。
（6）在配制母液时注意事项：
①培养基各试剂应使用分析纯。
②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。
③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期，并存放在4℃冰箱中。
使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。
5、结果记录与分析
（1）记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母液中各成分的称取量。
（2）仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题，如是否产生浑浊或沉淀，并分析出现混浊的原因。
6、思考题
（1）配置大量元素母液、铁盐母液时，应注意些什么？
（2）配置激素母液时，应注意些什么？
实验1-2植物组织培养基MS的配制与灭菌
1、目的要求
学习植物组织固体培养基的配制，学习高压灭菌器的使用，为外植体的接种与初代培养做准备。
2、基本原理
在植物组织培养中，固体培养基是最常用的一种培养基类型。
由于培养基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质，因此，培养基也是微生物繁殖的极好场所。
所以，必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。
本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗糖+1%琼脂，pH5.8。
配制1L为例，学习培养基的配制方法。
3、实验仪器和试剂
（1）仪器、用具
高压灭菌锅，超净工作台、分析天平（0.0001g）、pH计（或pH试纸）、微波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、烧杯（1000ml）、量杯、量筒（1000ml，100ml，50ml）、耐热皮筋（或棉绳）、100ml三角瓶（每人按3-4瓶准备）、培养皿（每2人按1套准备）、封口膜、定性滤纸等。
（2）试剂
①95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。
②MS培养基各母液、2-4D母液、蔗糖、琼脂。
（1）器皿准备清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培养皿、打孔器等，烘干或自然晾干备用。
（2）计算母液使用量
根据下面公式量取母液：
激素母液用量（mL）=————————————————————
配制1000ml培养基需要加入各母液的量分别为：
大量元素母液：
100ml微量元素母液：
10ml铁盐母液：
10ml
有机物母液：
10ml激素母液：
（3）配制
称取适量的琼脂（常用量10g/L）置于1000ml大烧杯中，加蒸馏水500ml左右，在微波炉中加热使之溶解，待琼脂完全溶化后，加入蔗糖（常用量30g/L），溶后，加入上述各种母液，最后，加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。
每组配制MS固体培养基1000ml，培养基组成为：
MS+1mg/L2,4-D+3%蔗糖+1%琼脂（pH5.8）。
（4）pH值调节
充分混合，待温度降至50℃～60℃时，用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH值到5.8，注意用玻璃棒不断搅动。
（5）分装
搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中（温度低于40℃以下琼脂就会凝固），每瓶25mL-30mL左右，1000mL培养基可以分装至30～40瓶，迅速盖上封口膜，用封口材料包上瓶口，扎口后，写上标记，注明配制者和配制日期，准备灭菌。
注意：
分装时不要把培养基弄到管壁上，以免日后污染。
（6）灭菌
培养基含有丰富的营养物质，有利于细菌和真菌繁殖，所以培养基配好后要及时灭菌，同时将接种用具，如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿（装有滤纸）等进行灭菌。
使用高压锅灭菌要注意以下几点：
①检查灭菌锅外层锅水位，水量过少时应加蒸馏水。
把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶。
盖上锅盖，上好螺栓后接通电源加热。
②排放冷空气，关闭放气阀，当灭菌锅盖上的压力表指针移至0.1Mpa（121℃），控制压力表稳定在该压力下15分钟，即达到灭菌目的。
③灭菌后，先切断电源，让灭菌锅温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基，置于水平台子
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