久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠病变氧化损伤的影响参考模板Word格式文档下载.docx

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结论久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎模型大鼠有显著的干预作用,其机制可能与抗氧自由基损伤,抑制NO、tNOS和iNOS生成,增强抗氧化酶活性有关。

【关键词】久泻灵冲剂；

溃疡性结肠炎；

谷胱甘肽过氧化物酶；

丙二醛；

超氧化物歧化酶；

一氧化氮；

一氧化氮合酶；

大鼠

Abstract：

ObjectiveToobservetheeffectsofJiuxielinggranulesonratswithulcerativecolitisandexploreitsmechanism.MethodsUlcerativecolitismodelswereestablishedbyimmunemethodcombinedwithlocalstimulationof5%aceticacid.Wistarratswererandomlydividedintocontrol,model,positivecontrolandlow,middle,highdoseJiuxielinggranulesgroup.Ratsinpositivecontrolgroupweretreatedwithsulfasalazine,andthoseinthreetreatmentgroupsweretreatedwithlow,middleandhighdosageofJiuxielinggranulesrespectivelyfor14dayscontinuously.24hoursafterlastadministration,theratswerekilledtoobtaincolonmucousmembranetotestGSH-Px,SOD,MDA,NO,tNOSandiNOSconcentrationofthehomogenateofcolonmucousmembrane.ResultsJiuxielinggranulescouldmarkedlyimprovethelevelsofGSH-PxandSODactivity,whereasdecreasethelevelsofMDA,NO,TNOSandiNOS.ConclusionJiuxielinggranulesexertitsmarkedcurativeeffectsonratsofulcerativecolonitisbyresistingoxygenfreeradicallesion,inhibitingthegenerationofNOandNOS,andenhancingtheactivityofantioxidase.

Keywords：

Jiuxielinggranules；

ulcerativecolitis；

GSH-Px；

MDA；

SOD；

NO；

NOS；

rat

　　溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC）是以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要临床症状,以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的一种慢性炎症性肠病。

该病治愈难度大,且愈后又常易复发。

近年来发现自由基的产生及脂质过氧化物反应增强与UC损伤的病理改变关系密切[1]。

本研究通过观察UC急慢性病变复合模型大鼠结肠组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）、总一氧化氮合酶（tNOS）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的变化及久泻灵冲剂对其的影响,旨在进一步了解其治疗UC的作用机制,为临床用药奠定实验基础。

　　1材料与方法

　　1.1动物及分组

SPF级Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重（180±

20）g,甘肃中医学院医学实验中心提供,动物合格证号：

医动字FCXK（甘）2004-2006。

实验动物按随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组及久泻灵大、中、小剂量组,每组10只。

　　1.2药物及试剂

处方组成：

黄连15g,法半夏10g,干姜10g,补骨脂15g,肉豆蔻15g,炒白术15g,党参18g,诃子肉10g。

饮片均购自甘肃同济医药公司,由甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定,临洮众友制药厂做成冲剂。

每克冲剂含相当于原药材1.42g。

醋酸,由天津市凯通化学试剂有限公司提供；

所有检测试剂盒均由南京建成公司提供。

　　1.3造模

参考文献[2-3]制作动物模型,取5只家兔的新鲜结肠之黏膜层,制成黏膜匀浆,冷冻24h,融冻后以3000r/min离心30min,取上清液提纯用考马斯亮蓝测定蛋白质含量,冰箱保存备用。

使用时加入完全福氏佐剂,模型组和久泻灵大、中、小剂量组于第1、14、21、28日分别于足跖内注射抗原2mg（末次注射不加佐剂）。

并用醋酸诱导结肠急性溃疡,于第21、28日用25%乌拉坦4mL/kg麻醉大鼠后,用特制包有圆头的软针头插入大鼠肛门内约8cm处结肠内,注入5%醋酸1mL。

空白组大鼠相同时间于足跖内、肛门内约10cm处结肠内注入等量生理盐水。

　　1.4给药

造模结束后,久泻灵冲剂大（13.5g/kg）、中（6.75g/kg）、小剂量（3.375g/kg）组配置成不同浓度的溶液,分别按2mL/次,2次/d灌胃；

阳性对照组予柳氮磺胺吡啶（SASP,0.2g/kg）,2mL/次,2次/d灌胃；

空白对照组与模型组每日给予生理盐水2mL/次,2次/d。

各组连续灌胃2周。

　　1.5结肠组织标本制备及指标检测

断头处死大鼠,低温条件下快速取结肠组织,以冰冷的生理盐水冲洗,滤纸吸干,称重后用眼科小剪刀尽快剪碎,置于匀浆器中,用9倍生理盐水匀浆（匀浆器的末端置于放冰块的冷水中）,后以3500r/min离心10min,取上清液置4℃冰箱保存。

结肠组织GSH-Px、SOD、MDA、NO、NOS由甘肃中医学院医学基础实验教学中心生化实验室检测,组织蛋白浓度通过考马斯亮蓝法测定,具体操作严格按说明书进行。

　　1.6统计学方法

应用SPSS11.5软件处理数据,实验数据以x±

s表示,统计方法采用方差分析检验,组间比较在方差齐时采用LSD法,方差不齐采时采用DennettT3法,P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1一般情况

正常组大鼠活泼好动,体重持续增长,大便正常。

其他各组大鼠造模后均出现弓背蜷卧、懒动厌食,体重普遍下降。

模型组大鼠稀便或半稀便,部分潜血阳性或肉眼黏液脓血便,多有肛周体毛沾染痕迹,且多数稀便持续到实验结束。

与模型组比较,久泻灵大、中剂量以及阳性对照组组则随着治疗的延续,大鼠症状均有不同程度的改善,摄食量普遍增加,体重恢复较快,大便成形也较早。

　　2.2久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、超氧化物歧化酶、一氧化氮、一氧化氮合酶含量的影响

　　（见表1）表1UC大鼠结肠组织匀浆中GSH-Px、SOD、MDA、NO、tNOS、iNOS含量变化（略）注：

与正常对照组比较,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01,▲▲▲P＜0.005；

与模型组比较,△P＜0.05,△△P＜0.01,△△△P＜0.005

　　3讨论

　　GSH-Px的作用是催化还原型谷胱甘肽生成氧化型谷胱甘肽,并能使有害的过氧化物还原为无害的羟基化合物,从而保护细胞膜结构和功能免受过氧化氢的氧化损伤,因此GSH-Px活性的变化也可反映机体抗氧化能力。

而脂质过氧化反应的中间产物MDA间接反映机体内细胞损伤的轻重和脂质过氧化的程度。

SOD能抑制脂质过氧化反应,清除超氧阴离子,保护细胞免受损伤,其活性的高低常间接反映了机体清除自由基的能力。

　　UC患者血清中NO水平明显增高,并与UC的病情呈一致的改变。

NO参与了UC发生过程中的炎症和组织损伤,对UC活动期患者的结肠黏膜作还原型辅酶Ⅱ（NADPH）检测发现：

黏膜隐窝中NADPH依赖性黄递酶（NADPH-diaphoresis,Nd）染色增多,表明在UC中有NOS存在,而在结肠黏膜层主要以iNOS为主[4]。

由于结肠固有肌层中存在iNOS,UC患者合并有细菌的病原体的感染,产生大量内毒素,使iNOS活性增强；

另外,炎性细胞因子亦可使iNOS活性增强,进而导致NO升高。

本研究显示：

与空白对照组比较,模型组大鼠结肠组织MDA含量升高（P＜0.01）,SOD、GSH-Px计数水平显著降低（P＜0.01,P＜0.05）,NO、TNOS及iNOS含量升高（P＜0.001）,说明急慢性病变复合模型造模成功。

与模型组比较,久泻灵冲剂大、中剂量组SOD、GSH-Px计数水平显著升高,组织MDA含量显著下降,说明久泻灵冲剂通过提高SOD、GSH-Px酶活性,清除MDA,有效地减少代谢产物的堆积,提高机体清除自由基的能力,并阻断自由基连锁反应,从而减轻因脂质过氧化物所导致的结肠组织损伤。

与模型组比较,久泻灵冲剂大、中剂量组NO、tNOS和iNOS水平均有下降,尤以久泻灵冲剂大剂量组作用明显。

说明其可通过改变NO、tNOS及iNOS含量,调节结肠黏膜血流、胃肠道分泌和运动,修复胃肠黏膜屏障,减少黏膜炎性细胞浸润,促进溃疡愈合。

　　自由基、活性氧主要是通过中性粒细胞“呼吸爆发”的形式产生的,大量的自由基可以引起膜脂质过氧化反应增强,破坏生物膜的结构和功能,形成一系列脂质自由基及其降解产物MDA,同时影响酶的活性,使SOD和GSH-Px等降解自由基的酶活性降低,相关酶活性的降低同时又不能有效降解已产生的大量自由基,形成恶性循环,加重组织损伤。

NO氧化破坏细胞的结构和功能,加剧和扩大结肠黏膜炎症及免疫损伤。

活动性结肠炎iNOS的活性明显增高,NOS抑制剂可明显改善结肠损伤的程度和范围,抑制iNOS产生NO可能是治疗UC的主要靶点之一[5-6]。

久泻灵冲剂具有调理阴阳、燮理虚实、补肾温肠、燥湿止泻的功能,全方体现攻涩兼施、辛开苦降、寒热并投、升降协调四大特点。

方中黄连、炒白术和党参有免疫调节作用；

黄连、法半夏、干姜及补骨脂有抗炎和抗溃疡的作用。

本实验结果表明,久泻灵冲剂通过升高SOD、GSH-Px的活性,提高机体抗自由基损伤的能力,清除MDA,降低NO、tNOS和iNOS的水平,对复合模型大鼠UC损伤有明显的保护作用。

【参考文献】

　　[1]黄俊,罗和生,李颖.大鼠实验性溃疡性结肠炎中NO、MDA、SOD的变化[J].医学文选,2001,20（6）：

757－759.

　　[2]徐淑云.药理实验方法学[M].第3版.北京：

人民卫生出版社,2002.1335.

　　[3]杨孝来,吴勇杰,葛斌.大鼠乙酸性结肠炎模型的实验研究[J].兰州大