食品中维生素的测定Word格式.docx

食品中维生素的测定Word格式.docx

《食品中维生素的测定Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品中维生素的测定Word格式.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

同时是展开剂。

（2）丙酮：

分析纯。

（3）丙酮＋石油醚（3:

7）（v/v）。

（4）无水硫酸钠：

（5）5%硫酸钠溶液。

（6）1：

1氢氧化钾溶液：

取50g氢氧化钾，溶于50mL水。

（7）无水乙醇：

需经脱醛处理。

（8）β-胡萝卜素标准溶液：

取5mgβ-胡萝卜素标准品，溶于10ml三氯甲烷中，浓度约为500μg/mL,准确测其浓度。

取标准溶液10.0μL，加正已烷3.00ml，混匀，测吸光值，比色杯厚度1cm，以正已烷为空白，入射光波长450nm，平行测定三分，取均值。

计算分式：

式中：

－胡萝卜素标准溶液浓度，mg/mL;

A－吸光值；

E－β-胡萝卜素在正已烷溶液中，入射光波长450nm，比色杯厚度为1cm，溶液浓度为1μg/ml的吸光系数，为0.2638；

－将μg/ml换算成mg/ml;

－测定过程中稀释倍数的换算；

（1）β-胡萝卜素标准使用液；

将已标定的标准液用石油醚准确稀释后，每毫升溶液相当50μg.避光保存于冰箱中。

3.仪器和设备

（1）实验室常用设备。

（2）玻璃层析缸。

（3）分光光度计。

（4）旋转蒸发器，具150mL球形瓶。

（5）恒温水浴锅。

（6）皂化回馏装置。

（7）点样器或微量注射器。

（8）新华滤纸：

定性，快速或中速，101号。

4.样品的采集和处理

（1）粮食：

样品用水洗三次，置60℃烤箱中烤干，磨粉，贮于塑料瓶内，放一小包樟脑精，盖紧瓶塞保存，备用。

（2）蔬菜与其他植物性食物：

取可食部用水冲洗三次后，用纱布吸去水滴，切碎，用匀浆器制成匀浆，贮于塑料瓶内，冰箱内保存备用。

5.测定步骤（以下步骤需在避光条件下进行）

（1）样品提取

①取适量样品，相当于原样1－5g（含胡萝卜素约20－80μg）的匀浆，粮食样品视其胡萝卜素含量而定，置100mL，带塞锥形瓶中，加入丙酮20mL，石油醚5mL，振摇1min，静置5min，将提取液转入盛有100mL5%硫酸钠溶液的分液漏斗中，再与锥形瓶中，加入10mL，丙酮＋石油醚混合液，振摇1min，静置5min，将提取液并入分液漏斗中。

如此提取2－3次，直至提取液无色为止。

②植物油和高脂肪样品，需先皂化，取适量样品（小于10g），加脱醛乙醇30mL再加10mL1：

1，氢氧化钾溶液，回流加热30min，然后用冰水使之迅速冷却，皂化后样品用石油醚提取，直至提取液无色为止。

（2）洗涤

①将提取液[5.

（1）①]静置分层，弃去下层水溶液，反复用5%硫酸钠溶液振摇洗涤，每次约15mL，直至下层水溶液清亮为止。

②将皂化后样品提取液[5.

（1）②]用水洗涤至中性。

③将①或②的石油醚提取液通过盛有10g无水硫酸钠的小漏斗，漏入球形瓶，用少量石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，洗涤液并入球形瓶内。

（3）浓缩与定容

将上述球形瓶内的提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，水浴温度为60℃，蒸发至约1ml时，取下球形瓶，用氮气吹干产即加入2.00mL石油醚定容，备层析用。

（4）纸层析

①点样：

在18cm×

30cm滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线取A、B、C、D四点（如图3-8所示），吸取0.100－0.400mL浓缩液[5.（3）]在AB和CD间迅速点样.

　　　　　　图3-8

②展开：

待纸上所点样液自然挥发干后，将滤纸卷为圆筒状，置于预先用石油醚饱和的层析缸中，进行上行展开。

③洗脱：

待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，将位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带剪下，产即放入盛有5mL石油醚的具塞试管中，用力振摇，使胡萝卜素完全溶于溶剂中。

（5）比色测定

用1cm比色杯，以石油醚调节零点，于450nm波长下测吸光度，以其值从标准曲线上查出萝卜素的含量，供计算时使用。

（6）标准曲线绘制

取β－胡萝卜素标准使用液（浓度为50μg/mL）1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00mL，分别置于100mL具塞锥形瓶中，按样品测定步骤进行操作，点样体积为0.100mL，标准曲线各点胡萝卜售量依次为2.50，5.00，7.50，10.00，15.00，20.00μg.为测定低含量样品，可在0至2.50μg间加做几点，以胡萝卜素含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线（见图3-9）。

图3-9实测图例胡萝卜素标准曲线图

6.计算

……………….（3-22）

式中：

X2――样品中胡萝卜素的含量，以β－胡萝卜素计，mg/100g;

c—在标准曲线上所查得的胡萝卜素的含量，μg；

V1――点样体积，mL；

V2――样品石油醚提取液缩后的定容体积，mL；

m—样品质量，g.

7.结果的允许差

同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值≤10％。

（二）维生素A和维生素E的高效液相色谱法（GB12388－90）

本方法适用于食物中维生素A和维生素E的测定。

样品中的维生素A及维生素E经皂化提取处理后，将其从不可皂化部分提取至有机溶剂中。

用高效液相色谱法C18反相柱将维生素A和维生素E分离，经紫外检测器检测，并用内标法定量测定。

最小检出量分别为维生素A：

0.8ng;

α-生育酚：

91.8ng；

γ－生育酚：

36.6ng；

δ生育酚：

20.6ng。

2.试剂

实验用水为蒸馏水；

试剂不加说明为分析纯。

（1）无水乙醚：

不含有过氧化物。

①过氧化物检查方法：

用5mL乙醚加1mL10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加4滴5g/L淀粉液，水层呈蓝色。

该乙醚需处理后使用。

②去除过氧化的方法：

重蒸乙醚时，瓶中放入纯铁丝或铁末少许。

弃去10％初馏液和10％残馏液。

（2）无水乙醇：

不得含有醛类物质。

①检查方法：

取2mL银铵溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热。

放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。

②脱醛方法：

取2g硝酸银，溶于少量水中。

取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。

将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处2天（不时摇动，促进反应），经过滤，置蒸馏瓶中蒸馏，弃去初蒸出的50mL。

当乙醇中含醛较多时，硝酸银用量适当增加。

（3）无水硫酸钠

（4）甲醇：

重蒸后使用。

（5）重蒸水水中加少量高猛酸钾，临用前蒸馏。

（6）抗坏血酸溶液（10%）（m/V）:

临用前进行配制。

（7）1:

1氢氧化钾溶液氢氧化钠溶液（10%）.

（8）硝酸银溶液（5%）（m/V）

（9）银氨溶液：

加氨水至5%硝酸银溶液中，直至生成的沉淀重新溶解为止，再加10%氢氧化钠溶液数滴，如发生沉淀，再加氨水直至溶解。

（10）维生素A标准液：

视黄醇（纯度85％）或视黄醇乙酸酯纯度90％）经皂化处理后使用。

用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg视黄醇。

临用前用紫外分光光度法分别标定其准确浓度。

（11）维生素E标准液：

α－生育酚（纯度95％）γ－生育酚（纯度95%）δ生育酚（纯度95%）用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1mL相当于1mg.临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。

（12）内标溶液：

称取苯并[e]芘（纯度98％），用脱醛乙醇配制成每毫升相当于10μg苯并[e]芘的内标溶液。

（13）pH1-14试纸

（2）高压液相色谱仪带紫外分光检测器。

（3）旋转蒸发器。

（4）高速离心机。

小离心管：

具塑料盖1.5－3.0mL塑料离心管（与高速离心机配套）。

（5）高纯氮气。

（6）恒温水浴锅。

（7）紫外分光光度计。

4.操作步骤

（1）样品处理

①皂化

称取1－10g样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体约为40μg）于皂化瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌，直到颗粒物分散均匀为止。

加5mL100g/L抗坏血酸，苯并[e]芘标准液2.00mL，混匀。

加10mL1:

1氢氧化钾溶液，混匀。

于沸水浴上回流30min使皂化完全。

皂化后立即放入冰水中冷却。

②提取

将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。

用约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液并入分液漏斗中。

如有残渣，可将此液通过有少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。

轻轻振摇分液漏斗2min，静置分导，弃去水层。

③洗涤

用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，用pH试纸检验水层不显碱性（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加）。

④浓缩

将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入与旋转蒸发器配套的250－300mL球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠3次，并入蒸发瓶内，并将其接至旋转蒸发器上，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹掉乙醚。

产即加入2.00mL乙醇，充分混合，溶解提取物。

⑤将乙醇液移入一小塑料离心管中[3.（4）]，离心5min（5000r/min）.上清液供色谱分析。

如果样品中维生素含量过少，可用氮气将乙醇液吹干后，再用乙醇重新定容。

并记下体积比。

（2）标准曲线的制备

①维生素A和维生素E标准浓度的标定方法

取维生素A和各维生素E标准液若干微升，分别稀释至3.00mL乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。

用比吸光系数计算出该维生素的浓度。

测定条件如表3-2所示。

表3-2

标准

加入标准的量S,uL

比吸光系数E1%cm

波长

λ，nm

视黄醇

γ－生育酚

δ－生育酚

α－生育酚

10.00

100.0

1835

71

92.8

91.2

325

294

298

浓度计算：

－某维生素浓度，g/mL;

－维生素的平均紫外吸光值；

S－加入标准的量，μL。

E－某种维生素1%比吸光系数；

－标准液稀释倍数。

②标准曲线的制备

本方法采用内标法定量。

把一定量的维生素A、γ－生育酚、α－生育酚、δ－生育酚及内标苯并〔e〕芘液混合均匀。

选择合适灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程70%，为高浓度点。

高浓度的

为低浓度点（其内标苯并〔e〕芘的浓度值不变），用此二种浓度的混合标准进行色谱分析，结果见色谱图。

维生素标准曲线绘制是以维生素峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素浓度为横坐标绘制，或计算直线回归方程。

如有微处理机装置，则按仪器说明用二点内标法进行定量。

图3-10维生素A和维生素E色谱图

本方法不能将β－E和γ－E分开，故γ－E峰中包含有β－E