常用的单克隆抗体检测方法Word文件下载.docx

常用的单克隆抗体检测方法Word文件下载.docx

《常用的单克隆抗体检测方法Word文件下载.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常用的单克隆抗体检测方法Word文件下载.docx（4页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

d、酶反应终止液（2mol/ＬH2SO４）:

取蒸馏水1７8、3ml，滴加浓硫酸（98%）21、7ml。

e、底物缓冲液（PH5、0，磷酸盐－柠檬酸缓冲液）：

取0、2mol/L　Na２HPO４　25、7ml,0、1ml/L柠檬酸２4、3mｌ，再加50ml蒸馏水．柠檬酸溶液及配成得底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。

f、底物使用液：

OPD底物使用液（测49０nm得OD值）:

ＯPD　５ｍg,底物缓冲液10mｌ,3％Ｈ2O20、1５ml。

ＴMBS或TMB底物使用液（测450nm得OＤ值）：

TMBS或TＭＢ（1mg／ｍl）1、0ml,底物缓冲液１0ｍl,1%　H2Ｏ225ｕl。

ＡＢTＳ底物使用液（测４1０nm得OＤ值）:

ＡBTＳ0、5mg,底物缓冲液１ml，3%H2Ｏ2　2ul。

g、抗体对照:

以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清.h、抗原:

可溶性抗原:

尽量纯化,以获得高特异性。

病毒感染得传代细胞或全菌抗原。

淋巴细胞等悬液。

ｉ、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其她类似试剂。

j、　细胞固定液:

-2０℃丙酮;

或丙酮—甲醛固定液：

Nａ２ＨPO410０mg,KH2PＯ4500mg,蒸馏水15０mｌ，丙酮225ｍl，甲醛125ml；

或丙酮—甲醛溶液（1；

1）；

或-20℃甲醇。

k、聚苯乙烯微孔板：

４0孔、96孔、或条孔；

硬板或软板均可使用．ｌ、酶联免疫阅读仪;

或光镜.m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。

②可溶性抗原得酶联免疫吸附试验（ELIＳＡ）ａ、纯化抗原用包被液稀释至1-２0ug/ml。

ｂ、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置４℃过夜或3７℃吸附2小时。

c、弃去孔内得液体，同时用洗涤液洗3次,每次３-５分钟,拍干。

d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭２小时；

该步骤对于一些抗原,可省略。

e、洗涤液洗3次;

此时包被板可-2０℃或4℃保存备用。

f、每孔加５0-100ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照与空白对照;

3７℃孵育1—2小时;

洗涤，拍干。

g、加酶标第二抗体,每孔50-1０0ul,3７℃孵育１—2小时，洗涤,拍干。

h、加底物液，每孔加新鲜配制得底物使用液50—10０uｌ，37℃10-３0分钟。

ｉ、以2ｍol/LＨ2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OＤ值.ｊ、结果判定:

以P/N2、1,或PN+３D为阳性。

若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。

③全菌抗原得ELＩSＡＳa、新鲜培养得细菌用蒸馏水或PBＳ悬浮,并调整细菌浓度至1×

１08个/mｌ。

必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作,最好就是灭活处理。

b、每孔中加１00ｕl５%戊二醛溶液（０、1mol/L　NaHCO３９5mｌ＋25％戊二醛溶液5mｌ）,３7℃作用2小时，蒸馏水洗涤3次;

加上述细菌悬液５0ul／孔；

37-5６℃烘干；

每孔加2０0ul封闭液4℃过夜或3７℃２小时封闭.c、步骤b也可采用先每孔加5０uｌ细菌悬液，37℃—５6℃烘干，然后用—2０℃预冷得无水甲醇室温作用15分钟,蒸馏水洗涤３次;

每孔加20０uｌ封闭液4℃过夜或3７℃２小时封闭。

ｄ、洗涤液洗３次;

此时包被板可在—２0℃或4℃保存备用.e、以下步骤同上法。

④用全细胞抗原得ELISＡa、按常规方法培养细胞,接种病毒，收获感染细胞与未感染细胞,进行细胞计数，用PＢS制成适当浓度悬液。

ｂ、淋巴细胞悬液得制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，1５00rpm离心3０分钟,吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液.该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0、８3%得氯化铵溶液，室温1０分钟,洗涤一次即可。

将该细胞悬液稀释至适当浓度。

c、每孔加１00ul上述ａ或b得细胞悬液，使每孔含细胞5×

104个;

1500r/min15分钟，甩去上清；

室温干燥或吹干后用丙酮—甲醇（１：

1）４℃固定1０分钟;

可４℃或—2０℃保存备用。

d、以下步骤同上法。

⑤抗体捕捉ELＩSA试验本法用抗ＢALB／c小鼠Ig得多克隆抗体捕捉待检样品中得ＭcAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。

该法就是常用得ELIＳA中较理想得一种；

其操作步骤如下：

a、以适当浓度得纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板,每孔加100uｌ，3７℃2小时或4℃过夜。

b、洗涤、拍干后加待测得ＭcAb样品,３7℃1—2小时。

c、洗涤后加适量得抗原,37℃１－２小时。

d、洗涤后加入酶标多克隆抗体,37℃1-2小时。

洗涤后加底物显色，判定结果。

⑥ABC-EＬIＳＡ试验AＢＣ—ELIＳA就是在常规ELISＡ原理得基础上,增加了生物素（Biotin）与亲与素（Avｉdin）间得放大作用。

亲与素有４个亚单位组成，对生物素有高度得亲合力。

生物素很易与蛋白质共价结合。

因此，结合了酶得亲与素与结合有抗体得生物素发生反应即起到了多极放大作用。

其操作步骤如下:

a、已知抗原得包被及加待检McＡb样品,同间接ELISA试验。

b、加生物素化抗鼠Ｉｇ抗体,每孔100ul，37℃　1小时；

洗涤。

c、加酶标亲与素，每孔1０0ｕl,3７℃30分钟洗涤;

加底物显色,判定结果。

⑦Dot-ELＩＳA试验免疫斑点试验（Ｄot-ELISA）就是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体,进行抗原抗体反应得免疫检测手段。

该法采用不溶性底物（如ＤAB,或4—氯萘酚或AgＮＯ3等）,其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而易于判定结果。

根据所用得标记物不同，可分为HRP免疫斑点试验、ＡＰ免疫斑点试验与免疫金银斑点法等。

其操作步骤大致如下:

a、将抗原液2-5uｌ点加于纤维素膜上,室温３7℃干燥.b、将纤维膜浸入封闭液中，37℃　3０分钟。

c、用洗涤液洗2次,吸干后加待检McAb样品,３7℃1小时;

用洗涤液振荡洗涤三次,每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记得抗鼠Ｉｇ抗体,３7℃作用３０分钟。

d、同法洗涤，吸干，用新配得相应底物溶液显色,然后水洗终止反应,观察结果．⑧免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分得ＭｃAb,常用得方法就是间接免疫过氧化物酶试验（IIP,indirｅcｔｉmmunoperｏxidase）及APAAP技术。

其结果用光镜或倒置显微镜检查.（２）免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原得杂交瘤抗体检测,如细胞性抗原（包括细菌与动物细胞）、感染细胞中得病毒抗原与膜抗原等。

其操作简单、敏感性高,可直接观察抗原定位等优点,在ＭcAb得筛选与鉴定上具有重要得应用价值。

①器材与试剂a、供检测抗体用得抗原制备固定细胞片或板，活细胞悬液。

ｂ、PBS（ＰＨ７、２，0、０１mｏl/L）c、待检得McAb样品。

d、冷丙酮e、FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记得抗鼠Ｉg抗体等f、荧光显微镜,磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。

②间接免疫荧光法a、固定细胞片得制备:

生长在盖片上得细胞（接种或未接种病毒）,可直接收获盖片,在ＰＢＳ中洗涤，用４℃丙酮固定１0分钟,空气干燥,置密封容器于-20℃保存备用;

单细胞悬液可在盖片上制成涂片,固定方法同上。

细胞涂片得制备:

将10ul细菌悬液（１×

1０8个／ml）涂抹7×

２1mｍ盖片上，自然干燥后，用—２0℃丙酮固定１0—15分钟,于-２0℃保存备用。

ｂ、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加1０—20ul杂交瘤上清或其她待检样品;

设立阳性、阴性对照;

置3７℃水浴孵育０、5-１小时。

c、取出盖片置PＢS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。

d、盖片置架上，滴加工作浓度得抗鼠Ig得荧光抗体10－20ul,37℃孵育0、５－1小时。

e、同法洗涤15分钟;

取出盖片,用延缓荧光碎灭得封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。

f、光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FIＴC为黄绿色荧光，ＴＲITC为桔红色荧光）。

g、细胞固定片得制备,也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上,在观察结果时,将培养板翻转置于荧光显微镜下,判断标准不变。

③细胞得膜荧光染色完整得活细胞得细胞膜,抗体不能透过。

如果细胞在4℃操作，则荧光染色仅限于细胞膜。

必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞得高活力。

活细胞得膜荧光染色大致步骤如下:

a、制备活性较好得细胞悬液,调节浓度至1０7个/ml.ｂ、在小试管（5×

50mｍ）中加入1０0ul细胞悬液,再加入100ul待检MｃAb得样品,混匀,4℃作用30－9０分钟。

c、用洗涤液（PＢＳ900ml，小牛血清５0ｍl，4%NaN3５0mｌ）洗二次,每次加洗涤液1-5mｌ,１000ｒ/ｍｉｎ离心５分钟,弃上清。

加入1０0ｕl荧光抗体,4℃作用３0—９０分钟.d、同法洗涤，将细胞重新悬于2０－3０ul含１0%甘油与1０-１０0ug苯二胺/ml得溶液中；

滴加于载玻片上,加盖片封载。

ｅ、立即在荧光显微镜上检查。

f、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查,或至少在4℃可保存一周。

（3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PHＡ）,就是目前应用较广得检测方法之一.本试验就是以包被可溶性抗原得红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上得抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象.可见,该法具有灵敏、快速、容易操作与无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差得缺点。

①器材与试剂ａ、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。

b、缓冲液:

PBS（ＰH7、2）;

醋酸缓冲液。

c、甲醛,丙酮醛,NaN３,抗凝剂等。

d、血凝板,振荡器等。

②多糖抗原得间接血凝试验a、甲醛化绵羊红细胞得制备:

无菌采集绵羊颈静脉血５0ml，用枸橼酸钠作抗凝剂;

用５倍于红细胞压积得PＨ7、２PBS（Ｎa2ＨＰO4·

１２H２O3、５8g,KH2PＯ40、4１g，NａCl　8、01g,蒸馏水１000ml）充分洗涤5次,每次１5０0r／min５—1０分钟,直至上清测定无蛋白质（用饱与硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀）,再以相同缓冲液配成２5%红细胞悬液;

将25%红细胞悬液与２0％甲醛以２、５：

1得比例混匀,３7℃水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色;

以PＨ7、2PBS洗涤4次,每次２000ｒ／mｉn10分钟,再以同样得PＢＳ制成2５%红细胞悬液；

其后,重复醛化一次,方法同前;

最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0、３%防腐，４℃保存备用。

b、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞得制备:

取脂多糖（LＰS）,以０、2mｏｌ/ＬPH8、0ＰB液，调整多糖浓度至１２0ｕg/ｍl,然后100℃水浴处理1小时;

将冷却至３7℃得热处理ＬPＳ与6%醛化红细胞等量混合,37℃搅拌作用45分钟；

取出离心２000r／mｉｎ1０分钟,以0、01ｍoｌ／ＬPH7、2PBS洗涤４次；

配制成