常用的单克隆抗体检测方法Word文件下载.docx

1、d、酶反应终止液（2mol/ H2SO）:取蒸馏水18、3ml，滴加浓硫酸（98%）21、7ml。e、底物缓冲液（PH5、0，磷酸盐柠檬酸缓冲液）：取0、2mol/LNaHPO25、7ml,0、1ml/L柠檬酸4、3m，再加50ml蒸馏水柠檬酸溶液及配成得底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测49nm得OD值）:PDg,底物缓冲液10m,3 2O2 0、1ml。MBS或TMB底物使用液（测450nm得O值）：TMBS或T（1mgl）1、0ml,底物缓冲液0l,1%H22 25l。T底物使用液（测1nm得O值）:BT 0、5mg,底物缓冲液ml，

2、3% H222ul。g、抗体对照:以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清.h、抗原: 可溶性抗原:尽量纯化,以获得高特异性。病毒感染得传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其她类似试剂。j、细胞固定液:-2丙酮;或丙酮甲醛固定液：NPO4 10mg,KH2P4 500mg,蒸馏水15m，丙酮225l，甲醛125ml；或丙酮甲醛溶液（1；1）；或-20甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：0孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用、酶联免疫阅读仪;或光镜.m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。可溶性抗原得酶联免疫吸附试验（ELI）、纯化抗原用包被液稀释至1-0ug/

3、ml。、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置过夜或3吸附2小时。c、弃去孔内得液体，同时用洗涤液洗3次,每次-分钟,拍干。d、每孔加200ul封闭液4过夜或37封闭小时；该步骤对于一些抗原,可省略。e、洗涤液洗3次;此时包被板可-2或4保存备用。f、每孔加0-100ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照与空白对照;3孵育12小时;洗涤，拍干。g、加酶标第二抗体,每孔50-10ul,3孵育2小时，洗涤,拍干。h、加底物液，每孔加新鲜配制得底物使用液5010u，3710-0分钟。、以2ol/L 2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取O值.、结果判定:以P/N2、1,或PN+D为

4、阳性。若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果。全菌抗原得ELSa、新鲜培养得细菌用蒸馏水或PB悬浮,并调整细菌浓度至108个/m。必须指出，对于人畜共患病病原体需注意安全操作,最好就是灭活处理。b、每孔中加00l %戊二醛溶液（、1mol/LNaHCO 5m25戊二醛溶液5m）,7作用2小时，蒸馏水洗涤3次;加上述细菌悬液0ul孔；37-5烘干；每孔加20ul封闭液4过夜或3 小时封闭.c、步骤b也可采用先每孔加5u细菌悬液，376烘干，然后用2预冷得无水甲醇室温作用15分钟,蒸馏水洗涤次;每孔加20u封闭液4过夜或3 小时封闭。、洗涤液洗次;此时包被板可在0或

5、4保存备用.e、以下步骤同上法。用全细胞抗原得ELISa、按常规方法培养细胞,接种病毒，收获感染细胞与未感染细胞,进行细胞计数，用PS制成适当浓度悬液。、淋巴细胞悬液得制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴细胞分离液之上，100rpm离心3分钟,吸取界面细胞洗涤二次，即为新鲜淋巴细胞悬液.该细胞悬液中若仍混有红细胞，离心后加0、3%得氯化铵溶液，室温1分钟,洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。c、每孔加00ul上述或b得细胞悬液，使每孔含细胞5104个;1500r/min 15分钟，甩去上清；室温干燥或吹干后用丙酮甲醇（：1）固定1分钟;可或2保存备用。d、以下步骤同上法。抗体捕捉E

6、LSA试验本法用抗ALBc小鼠Ig得多克隆抗体捕捉待检样品中得cAb，再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法就是常用得ELIA中较理想得一种；其操作步骤如下：a、以适当浓度得纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板,每孔加100u，3 2小时或4过夜。b、洗涤、拍干后加待测得cAb样品,7 12小时。c、洗涤后加适量得抗原,37 小时。d、洗涤后加入酶标多克隆抗体,37 1-2小时。洗涤后加底物显色，判定结果。ABC-EI试验AELIA就是在常规ELIS原理得基础上,增加了生物素（Biotin）与亲与素（Avdin）间得放大作用。亲与素有个亚单位组成，对生物素有高度得亲合力。生物素很易与蛋白质共价结合

7、。因此，结合了酶得亲与素与结合有抗体得生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下:a、已知抗原得包被及加待检Mcb样品,同间接ELISA试验。b、加生物素化抗鼠抗体,每孔100ul，371小时；洗涤。c、加酶标亲与素，每孔10l,3 30分钟洗涤;加底物显色,判定结果。Dot-ELA试验免疫斑点试验（ot-ELISA）就是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体,进行抗原抗体反应得免疫检测手段。该法采用不溶性底物（如AB,或4氯萘酚或Ag3等）,其与相应标记物（HRP、AP、胶体金）作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而易于判定结果。根据所用得标记物不同，可分为HRP 免疫斑点试验、免

8、疫斑点试验与免疫金银斑点法等。其操作步骤大致如下:a、将抗原液2-5u点加于纤维素膜上,室温7干燥.b、将纤维膜浸入封闭液中，373分钟。c、用洗涤液洗2次,吸干后加待检McAb样品,7 1小时;用洗涤液振荡洗涤三次,每次5分钟，加HRP或AP或胶体金标记得抗鼠抗体,7作用分钟。d、同法洗涤，吸干，用新配得相应底物溶液显色,然后水洗终止反应,观察结果免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成分得Ab,常用得方法就是间接免疫过氧化物酶试验（IIP,indirc mmunoperxidase）及APAAP技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查.（）免疫荧光技术免疫荧光技术可用于多种抗原得杂交瘤抗体检

9、测,如细胞性抗原（包括细菌与动物细胞）、感染细胞中得病毒抗原与膜抗原等。其操作简单、敏感性高,可直接观察抗原定位等优点,在cAb得筛选与鉴定上具有重要得应用价值。器材与试剂a、供检测抗体用得抗原制备固定细胞片或板，活细胞悬液。、PBS（、，0、ml/L）c、待检得McAb样品。d、冷丙酮e、FITC（异硫氰酸荧光素）或TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素）标记得抗鼠g抗体等f、荧光显微镜,磁力搅拌器，离心机，水浴箱等。间接免疫荧光法a、固定细胞片得制备:生长在盖片上得细胞（接种或未接种病毒）,可直接收获盖片,在中洗涤，用丙酮固定0分钟,空气干燥,置密封容器于-20保存备用;单细胞悬液可在盖片

10、上制成涂片,固定方法同上。细胞涂片得制备:将10ul细菌悬液（18个ml）涂抹71m盖片上，自然干燥后，用0丙酮固定015分钟,于-0保存备用。、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加120ul杂交瘤上清或其她待检样品;设立阳性、阴性对照;置3水浴孵育、5-小时。c、取出盖片置PS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。d、盖片置架上，滴加工作浓度得抗鼠Ig得荧光抗体1020ul,37孵育0、1小时。e、同法洗涤15分钟;取出盖片,用延缓荧光碎灭得封载剂（如缓冲甘油，9份甘油加1份PBS）封于干净载玻片上。f、光显微镜上观察，阳性结果可见特异性荧光（FIC为黄绿色荧光，ITC为桔红色荧光）。g、细胞固定片得制备

11、,也可改在培养板孔中进行，其余步骤同上,在观察结果时,将培养板翻转置于荧光显微镜下,判断标准不变。细胞得膜荧光染色完整得活细胞得细胞膜,抗体不能透过。如果细胞在4操作，则荧光染色仅限于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体，因此试验过程中要保证细胞得高活力。活细胞得膜荧光染色大致步骤如下:a、制备活性较好得细胞悬液,调节浓度至17个/ml.、在小试管（550m）中加入10ul细胞悬液,再加入100ul待检MAb得样品,混匀,4作用309分钟。c、用洗涤液（P 900ml，小牛血清0l，4%NaN3 0m）洗二次,每次加洗涤液1-5m,000/离心分钟,弃上清。加入10l荧光抗体

12、,4作用0分钟.d、同法洗涤，将细胞重新悬于23ul含0%甘油与1-0ug苯二胺/ml得溶液中；滴加于载玻片上,加盖片封载。、立即在荧光显微镜上检查。f、细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查,或至少在4可保存一周。（3）间接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验（PH）,就是目前应用较广得检测方法之一.本试验就是以包被可溶性抗原得红细胞作为指示系统，当被检抗体与包被在红细胞上得抗原产生特异性反应时，导致红细胞呈凝集现象.可见,该法具有灵敏、快速、容易操作与无需昂贵仪器等优点，而且经改用醛化红细胞以后，克服原来重复性差得缺点。器材与试剂、绵羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。b、缓冲液:

13、PBS（H7、2）;醋酸缓冲液。c、甲醛,丙酮醛,NaN,抗凝剂等。d、血凝板,振荡器等。多糖抗原得间接血凝试验a、甲醛化绵羊红细胞得制备:无菌采集绵羊颈静脉血0ml，用枸橼酸钠作抗凝剂;用倍于红细胞压积得P7、 PBS（a2O4HO 3、8g,KH2P4 0、4g，NCl8、01g,蒸馏水000ml）充分洗涤5次,每次50rmin 1分钟,直至上清测定无蛋白质（用饱与硫酸铵滴定上清，观察有无白色沉淀）,再以相同缓冲液配成5%红细胞悬液;将25%红细胞悬液与0甲醛以、：1得比例混匀,7水浴作用2小时，每15分钟振荡一次，红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色;以P7、2 PBS洗涤4次,每次000mn 10分钟,再以同样得P制成2%红细胞悬液；其后,重复醛化一次,方法同前;最后配成20%醛化绵羊红细胞悬液，加甲醛至0、%防腐，保存备用。b、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞得制备:取脂多糖（LS）,以、2m/ PH8、0 B液，调整多糖浓度至0g/l,然后100水浴处理1小时;将冷却至7得热处理P与6%醛化红细胞等量混合,37搅拌作用45分钟；取出离心000rm 1分钟,以0、01o PH7、2 PBS洗涤次；配制成