腺病毒中文操作手册Word下载.docx

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4.2.1共转化的一般原则5

4.2.2共转化方法5

4.2.3预期结果5

4.3AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6

4.4AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6

4.4.1细胞铺板6

4.4.2磷酸钙转化技术7

第五章常用技术8

5.1QBI-293A细胞培养8

5.1.1QBI-293A细胞的初始培养8

5.1.2QBI-293A细胞的维持培养和增殖8

5.1.3QBI-293A细胞的冻存8

5.2QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9

5.2.1感染QBI-293A细胞9

5.2.2病毒空斑形成9

5.2.3琼脂糖覆盖被感染细胞9

5.3MOI测定10

5.4腺病毒感染力测定10

5.4.1X-Gal染色11

5.5重组腺病毒的筛选和纯化11

5.5.1挑选最佳重组腺病毒：

表达和基因输送11

5.5.2病毒空斑挑选和小量扩增12

5.5.3Western杂交13

5.5.4Southern杂交和点杂交13

5.5.5病毒裂解产物PCR14

5.5.6免疫测定14

5.5.7功能测定14

5.6病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15

5.7两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16

5.7.1不连续密度梯度离心17

5.7.2连续密度梯度离心17

5.7.3病毒溶液去盐和浓集17

5.8病毒滴度测定18

5.8.1O.D.260nm（VP/ml）19

5.8.2空斑测定法20

5.8.350%组织培养感染剂量法20

第六章疑难解答22

6.1QBI-293A细胞培养22

6.2感染力测定22

6.3转移载体克隆23

6.4在BJ5183细胞中共转化和重组24

6.5转染QBI-293A细胞25

6.6筛选和测定25

6.7在QBI-293A细胞中表达26

6.8重组腺病毒的扩增26

6.9纯化26

6.10病毒滴度测定27

缩写英文全称中文全称

AdAdenovirus腺病毒

Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒

AdVAdenoviralVector腺病毒载体

AmpAmpicillin氨苄青霉素

β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶

bpBasePair碱基对

BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白

cDNAComplementaryDNA互补DNA

cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA

CPECytopathicEffect细胞病理效应

CsClCesiumChloride氯化铯

DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基

DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜

DTTDithiothreitol二硫苏糖醇

EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸

EtBrEthidiumBromide溴化乙锭

FBSFetalBovineSerum胎牛血清

HrHour小时

ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复

KanKanamycin卡那霉素

kbKilobases千碱基对

KDaKiloDaltons千道尔顿

LBLuria-Bertani（broth）LB培养基

MCSMultipleCloningSite多克隆位点

MinMinute分钟

MOIMultiplicityofInfection（Virus/Cell）感染复数

mRNAMessengerRNA信使RNA

MWCOMOIecularWeightCut-off

PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳

PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液

PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位

piPostInfection感染后

RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒

RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复

SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠

TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸

TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量

TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白

TETris/EDTATE溶液

wtWildType野生型

X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷

第一章简介

当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。

为解决这一问题，基因输送技术（通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒）通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。

重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。

1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。

迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。

1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。

此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。

迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：

Hittetal，1999和Wiveletal，1999。

腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massieetal，1998A,B）。

但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。

昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。

现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（Heetal，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。

重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。

AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。

这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。

AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。

第二章应用重组腺病毒的优点

1.宿主范围广,对人致病性低

这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。

腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。

2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因

逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。

腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。

腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。

3.能有效进行增殖，滴度高

这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。

4.无需辅助病毒，可容纳7.5kb外源DNA：

为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。

此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。

这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。

5.与人类基因同源

该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。

大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。

6.不整合到染色体中，无插入致突变性

逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。

而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。

在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。

7.能在悬浮培养液中扩增：

293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。

大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。

8.能同时表达多个基因

这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。

最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。

测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。

第三章AdEasyTM技术

3.1技术概览

AdEasyTM系统是由T.C.He等（1998）构建的用来代替传统腺病毒重组系统的一个快捷系统。

在这个系统中，只需二步即可产生重组腺病毒：

先将表达盒装入转移载体，然后再通过同源重组插入腺病毒基因组。

将外源基因插入腺病毒的最有效途径是通过同源重组，原因是：

1）腺病毒DNA是大型的线性分子，含有几乎所有的内切酶切位点；

2）基因组过大（36kb），难于操作。

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。

相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。

在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。

pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。

重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。

最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，IavertedTerminedRepeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。

同源重组在线性化的转移载体和完整的