大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因序列特征毕业作品Word文件下载.docx

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完成日期年月

摘要：

鱼类免疫球蛋白重链可变区中氨基酸的种类排列顺序千变万化，可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体，因此该基因的研究对提高鱼类免疫和防治病毒害有重要意义。

本实验通过对大黄鱼肌肉组织cDNA全长文库进行随即测序和分析得到大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因部分序列，然后进行生物信息学分析。

本序列长度为422bp，编码117个氨基酸。

本实验得到的序列与花狼鱼、双棘牛鱼、条纹婢翁、斜带石斑鱼、伯氏豚鰕虎鱼、南极鳕鱼的同源性较高，都有72%，与北极红点鲑的同源性较低，只有68%。

系统进化树分析中可知大黄鱼与笛鲷的亲缘关系较近，与硬头鳟、北极红点鲑的关系较远。

蛋白质分析中可知本序列分子量为13207.8DA。

等电点为6.71。

该试验结果为大黄鱼免疫球蛋白重链可变区基因功能的实验性鉴定工作奠定了基础。

关键词：

大黄鱼；

免疫球蛋白重链可变区；

序列分析

Abstract:

Fishimmunoglobulinheavychainvariableregionaminoacidsequenceofever-changingspecies,canbeformedwithdifferentcombinationofmanytypesofantigen-specificantibodies,sothegenesforimprovingfishimmuneandcontrolvirusanddamageissignificant.Inthisexperiment,RandomsequencingandanalysisofPseudosciaenacroceaskeletalmusclecDNAlibrary,andanalysisofbiologicalinformation.Thesequencelengthof422bp,encoding117aminoacids.ThesequenceofthisexperimentcomparedthegenewiththeAnarhichasmino,Bovichtusdiacanthus,Latrislineata,Epinepheluscoioides,PseudotrematomusbernacchiiandNototheniacoriiceps,theirhomologyhavereached72%,withSalvelinusalpinushavelowhomology,onlyis68%.PhylogenetictreeanalysisshowsthatPseudosciaenacroceaandLutjanussanguineusintheclosestrelationship,withOncorhynchusmykissandSalvelinusalpinusaredistant.Analysisshowsthatthesequenceoftheproteinmolecularweight13207.8DA,isoelectricpointof6.71.TheexperimentresultsforPseudosciaenacroceaimmunoglobulinheavychainvariableregiongeneprovidedabasisforfurtherstudyongenefunction.

Keywords:

Pseudosciaenacrocea;

immunoglobulinMheavychainvariableregion;

sequenceanalysis

引言

大黄鱼（Larimichthyscrocea），属于脊索动物门（Chordata）、硬骨鱼纲（Osteichthyes）、鲈形目（Perciformes）、鲈形亚目（Percoidei）、石首鱼科（Sciaenidae）、黄鱼属（Larimichthys），俗称黄鱼、黄瓜鱼、黄花鱼等，为暖温性集群洄游鱼类，分布于我国东海、南海和黄海南部，是我国主要海产经济鱼类之一。

主要生活在近海的中、下层，分为3个地理种群：

岱衢族、闽一粤东族和硇洲族。

大黄鱼肉质较好且味美，含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素，除鲜食和制成特色风味水产品外，还具有药用价值。

中医认为，黄鱼有和胃止血、益肾补虚、健脾开胃、安神止痢、益气填精之功效；

对贫血、失眠、头晕、食欲不振及妇女产后体虚有良好疗效。

免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，具有高特异性和高亲和性，普遍存在于哺乳动物的血液、组织和外分泌中[1]。

免疫球蛋白分子的基本结构是由四肽链组成的，即由二条相对分子量较小的轻链（lightchain,L链）和二条相对分子量较大的重链（heavychain,H链）组成，链间由二硫键和非共价键联结形成一个由4条多肽链构成的“Y”形的单体分子。

在Ig分子L链和H链的N端，L链1/2和H链约1/4处区域，氨基酸的种类和排列顺序随抗体特异性不同而有所变化，称为可变区（variableregion,V区），它赋予抗体以特异性[2]。

硬骨鱼类体内主要的免疫球蛋白种类为四聚体的IgM[3]，其重链基因座的组织形式与两栖动物和哺乳动物的一样，即上百个可变区基因区段（variable　segment,VH）位于多变区基因区段（clusterofdiversitysegment,D）的上游，然后是连接区基因区段（joiningsegment,JH），在3端则是4个恒定区基因区段（constantsegment,Cμ1~4）和2个跨膜区基因区段（trans-membranesegment,TM1~2）[4]。

在一个物种内，VH基因显示出广泛的序列多样性，一个物种的VH基因家族数越大，则表明其VH基因的多样性可能越大，产生的免疫球蛋白种类就越多。

一直以来，在科学家们的不懈努力下，已经成功突破了大黄鱼网箱养殖、人工繁殖的难关，使大黄鱼人工养殖得到迅猛发展，生产规模逐渐扩大，大黄鱼己成为我国海水网箱养殖数量最大的鱼种之一。

但是随着大黄鱼养殖密度的提高、养殖规模的扩大、养殖管理相对滞后以及养殖环境的污染，病害问题也陆续出现，已成为制约大黄鱼养殖业持续稳定发展的主要因素。

近年来，多方面的研究结果表明长期人工繁殖育种的大黄鱼出现了养殖品系的遗传退化、病危害频生、生长缓慢、性成熟提早、亲鱼个体变小及肉质变差等一系列问题。

目前，养殖大黄鱼的主要疾病有病毒病、细菌病和寄生虫病。

病害的防治主要使用抗生素。

滥用抗生素造成了耐药性增加、药物残留、污染环境等一系列负面影响[5~6]。

所以从大黄鱼自身的抗病能力入手，通过提高鱼体的自身免疫力来抵御病原微生物的侵袭是一个很好的途径。

免疫球蛋白是鱼类适应性体液免疫应答中最主要的介质，其基因结构是免疫球蛋白多样性产生的最根本的原因，它们代表了所能够产生的抗体种类的最少数量。

因此，大黄鱼免疫蛋白分子基础研究，相关基因分子特点与功能的研究，不仅可以对以鱼类为代表的低等脊椎动物免疫系统有个更深入的了解和认识，也可以为大黄鱼病害防治提供更为明确的理论证明。

获得整个基因组的信息有两种途径，一种是源于mRNA的cDNA测序，另一种是全基因组DNA测序。

全基因组测序虽然很有效，但耗费资金数额巨大，并且需要有效的计算机软件，有时还需要国际间合作；

而cDNA是指用于编码的基因，仅占全部基因组的2%[7]，长度为500～8000bp，方便克隆和测序，cDNA测序的流程一般是从cDNA文库中随机挑取克隆，然后进行单向测序，产生大量的约300～500bp的部分cDNA短序列，即ESTs（expressedsequencetags）序列。

自Adams等[8]在人类基因组计划研究中使用ESTs这一概念以来，ESTs技术已被广泛应用于组织特异性基因表达谱分析、新基因的克隆和基因组序列功能分许等多项研究领域。

EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选cDNA克隆，对其5’或3’端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术[9]。

ESTs测序分析目前已经成为大规模获取功能基因的一种最为有效和快捷的研究技术[10]。

本实验通过对大黄鱼肌肉组织cDNA全长文库进行EST测序及分析，获得免疫球蛋白重链可变区基因序列片段，然后对所得基因进行生物信息学分析。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1材料

-80℃冷藏的大黄鱼肌肉组织cDNA文库质粒。

1.1.2实验试剂

（1）质粒提取溶液I：

50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA（pH8.0），25mmol/LTris.Cl（pH8.0），高压蒸汽锅灭菌15min，40℃贮存；

（2）质粒提取溶液II：

0.2mo1/LNaOH（使用前需要用10mol/L贮存液稀释），1%SDS；

（3）质粒提取溶液III：

5ml冰乙酸，60m15mol/L乙酸钾，乙酸根终浓度为5mol/L，钾离子终浓度为3mo1/L，28.5m1水；

（4）异丙醇：

购于宁波奥博科学仪器有限公司；

（5）70%的乙醇：

取70ml的无水乙醇，加入蒸馏水定容到100ml。

无水乙醇为AR级，购于宁波奥博科学仪器有限公司；

（5）LB液体培养基：

蛋白胨10g，YeastExtract5g，NaCI5g，氨苄青霉素终浓度100µ

g/ml，pH7.0，定容到1L，高温高压灭菌30min；

（6）质粒提取试剂盒，TIANprep。

1.1.3主要仪器

（1）DYY-8B型稳压稳流电泳仪：

北京六一仪器厂；

（2）LX-100手掌型离心机：

江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；

（3）吉尔森可调精密移液器PEPETMAN：

法国GILSON公司；

（4）TCL-16B高速台式离心机：

上海安亭科学仪器厂；

（5）HZ-9211K恒温振荡器：

太仓市科教器材厂；

（6）DELTA320pH计：

梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；

（7）REVCD1386-3V型超低温冰箱：

美国REVCD公司；

（8）Biofugefresco高速台式冷冻离心机：

美国SORVALL公司。

1.1.4主要耗材

1.5ml离心管、各型号枪头、无粉乳胶手套和口罩：

均购自江苏省通州市南兴申海玻璃仪器厂。

1.2实验方法

1.2.1细菌扩大培养

将带有质粒的大肠杆菌接种到LB液体培养基中，37℃振荡培养12～16小时，直至长出菌落。

1.2.2质粒提取

常规提取质粒步骤按文献[11~12]进行，再根据本实验室情况加以调整。

（1）将菌落接种到96孔板上，每孔中加入1ml的培养物，37℃过夜，室温培养；

3000rpm离心5min，弃去上清液，倒置至晾干。

（2）加入200μl质粒提取液solutionI，封膜后，用振荡器充分振荡，直到板底无沉淀出现为止，再加入200μl质粒提取液solutionII，用胶带封住口，轻轻反复颠倒5次（切勿剧烈振荡）。

（3）然后加入200μl冷的质粒提取液solutionIII，同样用胶带封口，反复颠倒1