分子生物学综合性大实验文档格式.docx

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MolecularcloningofDNAmoleculesinvitroinaccordancewithestablishedobjectivesandprogramsofartificialrecombination,therecombinantmoleculeintoanappropriaterecipientcelltoamplifyandmultiplyinthecellsinordertoobtainalargenumberofreplicationDNAmolecule,andItistheprocessofreceptorcellstoacquirenewgeneticcharacteristics.Thebasicprincipleisthegeneencodingapolypeptideorprotein（foreigngene）isassembledtothebacterialplasmid（double-strandedcircularDNAplasmidmoleculeoutsidethebacterialchromosome）inthisplasmidwasthentransformedintoEscherichiacoliinvivo,thustherecombinantplasmidtoreplicatewiththevalueoftheE.coli,goouttoexpressthecorrespondinggeneencodesapolypeptideorprotein.

Keywords:

DNAextraction,PCRgeneamplification,ligation,transformationfiltering,digestion

1材料与方法

1.1实验材料

青稞actin基因

1.2实验试剂及仪器

1.2.1DNA提取

仪器

试剂

移液器及吸头

1.5ml离心管

陶瓷研钵

水浴锅

台式高速离心机。

2%CTAB抽提缓冲溶液

氯仿－异戊醇（24：

1）

异丙醇

3M的醋酸钠（pH5.2）

无水乙醇、75%乙醇

TE（10mmol/LTris·

Cl，1mmol/LEDTA，pH8.0）缓冲液

凝胶电泳上样缓冲液（0.4%溴酚蓝、50%蔗糖指示剂溶液）

溴化乙锭溶液（剧毒）（10mg/ml溶液）

1×

TAE凝胶电泳缓冲液

1.2.2PCR扩增DNA

PCR热循环仪

琼脂糖凝胶电泳系统

吸头

离心管

1.0μΜ上游引物primerU

1.0μM下游引物permerL

DNA模板

ddH2O

MaxterMix

1.2.3PCR产物回收

紫外观察分析仪（波长302nm）

离心机（Eppendoff）

单面刀片

TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0

50×

TAE

DdH2O

1.2.4重组质粒的连接

恒温烘箱

恒温水浴箱

10×

T4DNA连接酶Buffer

ddH2O

1.2.5重组质粒的转化及蓝白斑筛选

1.2.6质粒DNA抽提

eppendorf管

微量取液器（20μl,200μl,1000μl）

台式高速离心机

涡旋振荡器

LB液体培养基

溶液Ⅰ

溶液Ⅱ

溶液Ⅲ

RNA酶A

饱和酚:

氯仿＝1:

1

溶液Ⅰ：

50mM葡萄糖；

25mMTris·

HCl（pH8.0）；

10mMEDTA

溶液Ⅱ：

（新鲜配制）0.2NNaOH；

1%SDS

溶液Ⅲ：

5MKAC10ml；

冰醋酸11.5ml；

水28.5ml

1.2.7DNA酶切

微量移液器

离心机

Pst-I

1.2.8菌液PCR

1.3研究方法与实验步骤

1.3.1DNA提取（CTAB法）

（1）原理

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethylammomumbromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

（2）步骤

①首先将植物组织洗净，2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。

②取少量叶片（约0.1-1g）置于灭过菌的研钵中，磨至粉状，叶片磨得越细越好。

加入700µ

L的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；

将磨碎液吸入1.5mL的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二，混合使之充分摇匀于65℃，60min（时间长,DNA产量高），不时混匀（每5min反转摇匀一次）；

③冷却2min后，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：

1）至满管，剧烈振荡2～3min，使两者混合均匀；

放入离心机中10000rpm离心15min，与此同时，将600µ

L的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中。

④移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物,-20℃放置30min；

⑤10000rpm离心5min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的滤纸上,60s后，直立离心管，加入720µ

L的75%乙醇及80µ

L5M的醋酸钠，轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；

⑥放置15min，使DNA块状物的不纯物溶解；

10000rpm离心1min后，倒掉液体，再加入800µ

L75%的乙醇，将DNA再洗15min；

710000rpm离心30s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；

数分钟后，直⑧加入50µ

L0.5×

TE（含RNase）缓冲液（超纯水代替），使DNA溶解，置于37℃恒温箱约30min，使RNA消解；

8将提取的DNA溶液使用核酸检测仪检测浓度，再使用1％的琼脂糖电泳鉴定。

1.3.2琼脂糖凝胶电泳

①1g琼脂糖加入100mL1×

TAE电泳缓冲液中,摇匀。

在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解.（冷却到60℃,加入2µ

L的10mg/mLEB,并摇匀）。

②将凝胶板放入凝胶槽中,插入梳子,将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入凝胶槽中,室温冷却凝固，小心垂直向上拔出梳子。

③充分凝固后，将凝胶置入电泳槽中,加1×

TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,用移液④打开电源开关,调节电压至120V,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约15－30min紫外灯下观察。

其余DNA样品保存在20C备用。

这次电泳主要是检测所提取的DNA的质量和浓度。

1.3.3PCR扩增DNA

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。

它包括:

变性（Denature）、退火（Anneal）和延伸（Extension）三个基本步骤。

这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA扩增达106倍。

PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸

Step1.变性：

加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

Step2.退火：

溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

Step3.延伸：

溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3’-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按5’－3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：

DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个DNA引物、耐热Taq聚合酶

PCR反应体系：

PCR扩增反应总量

25μL

1μL

1.0μM下游引物permerL

DNA模板

ddH2O

9.5μL

PCRMaxterMix

12.5μL

按下述程序进行PCR扩增:

195℃预变性3min；

295℃变性45s；

360℃退火45s；

472℃延伸1min；

5重复步骤2~4,30次；

672℃延伸10min；

7End

1.3.4PCR产物回收

①将单一的目的DNA条带切下，放入干净离心管中，称重；

②加入三倍体积溶胶液（0.1g:

300μl），50-55℃水浴放置10min,不断温和翻转，使胶块充分溶解；

注：

溶胶时，若溶液变为红色（正常为黄色），可加入10-30μl3M醋酸钠（PH=5.2）使之变为淡黄色；

③将溶液加入吸附柱中，12000rpm离心30-60s，倒掉废液；

溶液冷却后再过柱

④再加入600μl潭洗液（加无水乙醇），12000rpm离心1min,弃废液；

⑤再次加入600μl潭洗液，12000rpm离心1min,弃废液；

⑥空管离心12000rpm2min，除去潭洗液，放置数分钟；

⑦将吸附柱放入一个干净的离心管中，滴加适量65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min,12000rpm离心1min；

可将离心管洗脱液重新加入吸附柱，再次离心；

洗脱液体