分子生物学综合性大实验文档格式.docx

1、 Molecular cloning of DNA molecules in vitro in accordance with established objectives and programs of artificial recombination, the recombinant molecule into an appropriate recipient cell to amplify and multiply in the cells in order to obtain a large number of replication DNA molecule, andIt is th

2、e process of receptor cells to acquire new genetic characteristics. The basic principle is the gene encoding a polypeptide or protein （foreign gene） is assembled to the bacterial plasmid （double-stranded circular DNA plasmid molecule outside the bacterial chromosome） in this plasmid was then transfo

3、rmed into Escherichia coli in vivo, thus the recombinant plasmid to replicate with the value of the E. coli, go out to express the corresponding gene encodes a polypeptide or protein.Keywords: DNA extraction, PCR gene amplification, ligation, transformation filtering, digestion1材料与方法1.1实验材料青稞actin基因

4、1.2实验试剂及仪器1.2.1DNA提取仪器试剂移液器及吸头1.5ml离心管陶瓷研钵水浴锅台式高速离心机。2% CTAB 抽提缓冲溶液氯仿异戊醇（24：1）异丙醇3 M的醋酸钠（pH5.2）无水乙醇、75%乙醇TE（10mmol/L TrisCl，1mmol/L EDTA，pH8.0）缓冲液凝胶电泳上样缓冲液（0.4%溴酚蓝、50%蔗糖指示剂溶液）溴化乙锭溶液（剧毒）（10mg/ml溶液）1TAE凝胶电泳缓冲液1.2.2PCR扩增DNAPCR热循环仪琼脂糖凝胶电泳系统吸头离心管1.0上游引物primerU 1.0M下游引物permerL DNA 模板 dd H2O Maxter Mix1.2.

5、3PCR产物回收紫外观察分析仪（波长302 nm）离心机（Eppendoff）单面刀片TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.050TAEDdH2O1.2.4重组质粒的连接恒温烘箱恒温水浴箱10T4 DNA 连接酶 Buffer ddH2O1.2.5 重组质粒的转化及蓝白斑筛选1.2.6质粒DNA抽提eppendorf管微量取液器（20l,200l,1000l）台式高速离心机涡旋振荡器LB液体培养基溶液溶液溶液 RNA酶A 饱和酚:氯仿 1:1 溶液：50mM 葡萄糖；25mM TrisHCl（pH8.0）；10mM EDTA溶液：（新鲜配制

6、）0.2N NaOH；1% SDS溶液：5M KAC 10ml；冰醋酸 11.5ml；水 28.5ml1.2.7DNA酶切微量移液器离心机Pst-I1.2.8菌液PCR1.3研究方法与实验步骤1.3.1DNA提取（CTAB法）（1）原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类）对DNA 的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠（sarkosyl） 、十六烷基三甲基溴化铵（hexadyltrimethyl ammomum

7、 bromide，简称为CTAB）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS）等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA 得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA）水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。（2）步骤首先将植物组织洗净，2%CTAB抽提缓冲液在65水浴中预热。取少量叶片（约0.1-1g）置于灭过菌的研钵中，磨至粉状，叶片磨得越细越好。加入700L的2%CTA

8、B抽提缓冲液，轻轻搅动；将磨碎液吸入1.5mL的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二，混合使之充分摇匀于65，60min （时间长,DNA 产量高），不时混匀（每5min反转摇匀一次）；冷却2 min后，加入等体积的氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡23 min，使两者混合均匀；放入离心机中10 000 rpm离心15min，与此同时，将600L的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中。移液器轻轻地吸取上清液，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物,-20放置30 min；10000 rpm离心5 min后，立即倒掉液体，注意勿将

9、白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的滤纸上,60 s后，直立离心管，加入720L的75%乙醇及80L5 M的醋酸钠，轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；放置15 min，使DNA块状物的不纯物溶解；10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 L 75%的乙醇，将DNA再洗 15 min；7 10000 rpm离心30 s后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直加入50L0.5 TE（含RNase）缓冲液（超纯水代替），使DNA溶解，置于37恒温箱约30min，使RNA消解；8 将提取的DNA溶液使用核酸检测仪检测浓度，再使用1的琼

10、脂糖电泳鉴定。 1.3.2琼脂糖凝胶电泳1g 琼脂糖加入100mL 1TAE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解.（冷却到60,加入2L的10mg/mL EB,并摇匀）。将凝胶板放入凝胶槽中,插入梳子,将溶解的琼脂糖（约50）倒入凝胶槽中,室温冷却凝固，小心垂直向上拔出梳子。充分凝固后，将凝胶置入电泳槽中,加1TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,用移液打开电源开关,调节电压至120V,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约1530min紫外灯下观察。其余DNA样品保存在 20 C备用。这次电泳主要是检测所提取的DNA的质量和浓度。1.3.3PCR扩增DNA聚合酶链式反应（

11、Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种选择性体外扩增DNA的方法，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 它包括: 变性（Denature） 、 退火（Anneal）和延伸（Extension）三个基本步骤。这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经2535轮循环就可使DNA扩增达106 倍。PCR反应包括三个基本步骤变性、退火和延伸Step1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。Step2. 退火：溶液温度降至5060，模板DNA

12、与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。Step3. 延伸：溶液反应温度升至72，耐热DNA聚合酶以单链为模板，利用引物的3-OH，以反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物，按53方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个DNA引物、耐热Taq聚合酶 PCR反应体系：PCR扩增反应总量25L1L1.0M下游引物permerLDNA 模板dd H2O 9.5LPCR Maxter Mix12.5L按下述程序进行PCR扩增:1 95 预变性 3 min；2 95 变性 45s；3 60 退火 45s；

13、4 72 延伸 1 min；5 重复步骤24, 30次；6 72 延伸 10 min；7 End 1.3.4 PCR产物回收 将单一的目的DNA条带切下，放入干净离心管中，称重； 加入三倍体积溶胶液（0.1g:300l），50-55水浴放置10min,不断温和翻转 ，使胶块充分溶解；注：溶胶时，若溶液变为红色（正常为黄色），可加入10-30l3M醋酸钠（PH=5.2）使之变为淡黄色；将溶液加入吸附柱中，12000rpm离心30-60s，倒掉废液；溶液冷却后再过柱再加入600l潭洗液（加无水乙醇），12000rpm离心1min,弃废液；再次加入600l潭洗液，12000rpm离心1min,弃废液；空管离心12000rpm2min，除去潭洗液，放置数分钟；将吸附柱放入一个干净的离心管中，滴加适量65水浴预热的洗脱液，室温放置2min,12000rpm离心1min；可将离心管洗脱液重新加入吸附柱，再次离心；洗脱液体