整理基因工程复习提纲完善Word文档下载推荐.docx

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（1）从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；

（2）在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子;

（3）将重组DNA分子引入（转）到受体细胞（亦称宿主细胞或寄主细胞）;

（4）从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆;

（5）将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。

5．基因工程的技术准备及技术支撑。

技术准备

技术支撑：

核酸凝胶电泳技术

核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR）技术

5．基因工程的基本用途

分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源

大规模生产生物活性物质

设计、构建生物的新性状甚至新物种

基因工程在农业生产中的应用

1.提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物

基因工程在工业中的应用

1.纤维素的开发利用2.酿酒工业

基因工程在医药上的应用

1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗

基因工程在环境保护中的应用

1.检测水污染2.生物降解

7．核酸酶的分类

1）根据核酸底物分

RNA酶（Rnase）/DNA酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶；

2）根据作用方式分

内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease）；

3）根据对底物碱基专一性分

碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）

非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）

8．细菌中的防卫系统：

限制与修饰现象。

（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。

这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。

如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。

（2）限制性核酸内切酶：

可以帮助细菌限制外来DNA的入侵

（3）甲基化酶：

对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。

（4）细菌自身的DNA——受到甲基化修饰，得以保存。

（5）外源入侵的DNA——未来得及甲基化，被降解。

9．作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5α）的必须条件

（1）rec基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组；

（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。

10．限制性核酸内切酶

（1）最重要的是哪一类？

II型

（2）命名

（3）II型限制性内切酶的基本特征

1.识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列

2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧

3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

4.某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变

（4）回文结构

序列正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。

（5）限制性内切酶形成的末端结构

粘末端：

两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；

平末端：

两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。

（6）Staractivity

一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。

（7）同裂酶：

一类来源不同，但识别靶序列相同，切割位点可以相同也可以不同的酶。

（8）同尾酶：

一类来源不同，识别靶序列不同，但是都产生相同的粘性末端的酶。

（9）同位酶：

一类识别靶序列相同，但切割位置不同的酶。

（10）限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用；

（11）在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌（识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性）

11．DNA聚合酶

（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）的用途：

缺口平移（Nicktranslation）

5’→3’的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进

（2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

性质:

Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。

用途：

补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端/cDNA第二链的合成

（3）T4-DNA聚合酶

性质：

5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性/在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切/在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止/在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端

（4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

基本特性：

以RNA为模板聚合cDNA链/双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

主要用途：

将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库/对具有5‘突出端的DNA片段的3’端进行补平和标记、制备探针

12．DNA连接酶：

形成磷酸二酯键（DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分）

（1）防止连接反应中载体或目的基因的自我环化

1.双酶切2.碱性磷酸酶去除5’-P3.调整反应物比例（P102）

（2）平末端DNA片段的连接方法

1.直接用T4DNA连接酶连接（需ATP和高浓度酶，效率不高）

2.TdT同聚物加尾法

3.用衔接物连接平末端DNA分子（T4DNALigase）

3.DNA接头连接法

11．核酸酶（nuclease）

（1）单链核酸内切酶——S1核酸酶的

基本反应：

内切单链DNA或RNA/内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA

去除DNA片段的单链突端，使之成为平端/去除cDNA合成时形成的发夹结构/施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物/成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子/修整渐进性删除突变的末端

（2）单链内切、双链外切的核酸酶：

Bal31核酸酶

特性：

从双链DNA的两端3‘和5’同时开始水解两条链，对两条链的水解速度不一定相等，结果是双链从两头缩短，彻底水解为5‘单核苷酸。

12．核酸修饰酶（NucleicAcidmodificationenzymes）

（1）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）

不需要模板的DNA聚合酶，在3’端随机掺入dNTPs

给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾/DNA片段3’末端的同位素标记

（2）碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP）

反应：

去除5’-P，成为5’-OH

目的：

1.去除载体DNA5’端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率

2.去除DNA和RNA的5’-P，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。

（3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）

催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5’-OH末端上

用于探针的末端同位素标记

13．核酸凝胶电泳结果处理软件：

quantityone（了解）

14．基因克隆载体：

概念：

能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子

种类：

质粒（plasmid）/噬菌体或病毒DNA/考斯质粒（cosmid）与噬菌粒/人造染色体载体

功能：

1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件

应具备的条件：

1.可转移性：

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性

2.具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，originofreplication）或整合位点

3.具有较高的外源DNA的装载能力

4.多克隆位点（multiplecloningsite,MCS）：

具有多种限制性内切酶的单一切点

5.具有合适的筛选标记（selectionmarker）

6.安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中

（1）质粒：

质粒是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。

天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA

（2）什么是质粒的不相容性及其机制；

不相容性：

任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。

机制：

两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。

两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。

（3）根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型（严紧型和松弛型），其中氯霉素的作用（蛋白质合成抑制剂，使染色体DNA合成受阻，松弛型继续扩增，极大提高拷贝数）；

根据是否可以在细胞间转移，质粒可以分为（结合型和非结合型）；

（4）质粒的性质

自主复制性（质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制）、不相容性、可转移性

（5）一个合格质粒的组成要素

1.具有复制起始位点（Ori）或整合位点

2.具有两种易被检测的选择性标记（抗生素抗性基因）

3.具有多种限制酶的单一识别位点（多克隆位点MCS）

4.具有尽可能小的相对分子质量

5.属于松弛型复制

6.属于非传递型质粒

7.具有较高的外源DNA装载能力

8.P/E（Promoter/Enhancer）：

启动子/增强子

9.T（Terminator）：

终止信号

10.poly（A）加尾信号：

稳定mRNA

（6）如何阅读质粒图谱

（7）重要的大肠杆菌质粒载体

pBR322

松弛型复制/氯霉素可扩增/拷贝数每细胞50-100/用于基因克隆

pUC18/19

拷贝数2000-3000/cell

装有多克隆位点（MCS）

正选择颜色标记lacZ’（E.coli的lacZ基因的5’-序列，表达半乳糖苷酶的α片段。

LacZ’的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O）

用于基因克隆和测