整理基因工程复习提纲完善Word文档下载推荐.docx

1、（1） 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；（2） 在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子;（3） 将重组DNA分子引入（转）到受体细胞（亦称宿主细胞或寄主细胞）;（4） 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆;（5） 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。5基因工程的技术准备及技术支撑。技术准备技术支撑：核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR）技

2、术5基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2. 生物降解7核酸酶的分类1）根据核酸底物分 RNA酶（Rnase）/DNA酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分

3、内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease）；3） 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。（1）细菌在其感受态的生理条件下，很容易吸收外源DNA进入体内。这种感受态可以是人为的，也可以是在自然条件下发生的。如果细菌不加限制地接受所有的外源DNA，细菌本身就会很快发生遗传变异甚至死亡。（2）限制性核酸内切酶：可以帮助细菌限制外来DNA的入侵（3）甲基化酶：对该特异位点的碱基进行甲基化修饰，被修饰的DNA就不再被相应的限制酶切割了。（4）细菌自身的DNA

4、受到甲基化修饰，得以保存。（5）外源入侵的DNA未来得及甲基化，被降解 。9作为分子克隆宿主菌的大肠杆菌（如DH5）的必须条件（1）rec基因缺陷型的突变体，保证必须不与外来DNA分子发生遗传重组；（2）限制系统缺陷或限制与修饰系统均缺陷的菌株，保证外来DNA分子不会受其限制酶的降解。10限制性核酸内切酶（1）最重要的是哪一类？II型（2）命名（3）II型限制性内切酶的基本特征1.识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列2.大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧3.识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构4.某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变（4）回文结构序列

5、正读和反读是一样的，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向读序列是完全一样的。（5）限制性内切酶形成的末端结构粘末端：两条链上的断裂位置是交错和对称围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘末端的DNA片段；平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称轴的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。（6）Star activity一些限制性内切酶在某些反应条件变化时酶的专一性发生改变，如甘油浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变、有机溶剂的影响等条件，酶切割位点专一性发生改变。（7）同裂酶：一类来源不同，但识别靶序列相同，切割位点可以相同也可以不同的酶。（8）同尾酶：一类来源不同，识

6、别靶序列不同，但是都产生相同的粘性末端的酶。（9）同位酶：一类识别靶序列相同，但切割位置不同的酶。（10）限制酶的识别序列与DNA的来源无关，不带有种的特征，对各种DNA都普遍适用；（11）在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌（识别序列中特定核苷酸的甲基化会强烈抑制限制酶的活性）11DNA聚合酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA pol I）的用途：缺口平移（ Nick translation ）53的核酸外切酶和聚合酶活性协同作用，使缺口向前推进（2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）性质: Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性，但失去了53的核

7、酸外切酶活性。用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端/cDNA第二链的合成（3）T4-DNA聚合酶性质：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性/在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切/在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止/在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位切平由核酸内切酶产生的3粘性末端（4）依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链/双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链主要用途：将真核基因的mRNA转录成cDNA，构建cDNA文库/对具有5突出端的DNA片段的3端进行补平和标记、制备探针12DNA连接酶：形成磷酸二酯键（DNA

8、连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分）（1）防止连接反应中载体或目的基因的自我环化1.双酶切 2.碱性磷酸酶去除5-P 3.调整反应物比例（P102）（2）平末端DNA片段的连接方法 1.直接用T4 DNA连接酶连接（需ATP和高浓度酶，效率不高）2.TdT同聚物加尾法3.用衔接物连接平末端DNA分子（T4 DNA Ligase）3.DNA接头连接法11核酸酶（nuclease）（1）单链核酸内切酶S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA/内切带缺口或裂口的双链DNA或RNA去除DNA片段的单链突端，使之成为平端/去除cDNA合成时形

9、成的发夹结构/施行S1核酸酶保护实验，分析转录产物/成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合此酶水解，可定位内含子/修整渐进性删除突变的末端（2）单链内切、双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶特性：从双链DNA的两端3和5同时开始水解两条链，对两条链的水解速度不一定相等，结果是双链从两头缩短，彻底水解为5单核苷酸。12核酸修饰酶（Nucleic Acid modification enzymes）（1）末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，在3端随机掺入dNTPs给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾/DNA片段3末端的同位素标记（2）碱性磷酸单酯酶（CIP、BAP）反应：去除5-

10、P，成为5-OH目的：1.去除载体DNA5端磷酸，防止载体自身环化，提高重组率 2.去除DNA和RNA的5-P，然后用T4多聚核苷酸激酶作用下进行末端标记。（3）T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）催化ATP的g-磷酸基团转移至DNA或RNA的5-OH末端上用于探针的末端同位素标记13核酸凝胶电泳结果处理软件：quantity one（了解）14基因克隆载体：概念：能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子种类：质粒（plasmid）/噬菌体或病毒DNA/考斯质粒（cosmid）与噬

11、菌粒/人造染色体载体功能：1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件应具备的条件：1.可转移性：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性2.具有与受体细胞相适应的复制位点（ori，origin of replication）或整合位点 3.具有较高的外源DNA的装载能力4.多克隆位点（multiple cloning site, MCS）：具有多种限制性内切酶的单一切点 5.具有合适的筛选标记（selection marker）6.安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其他生物细胞中（1）质粒：质粒是生物细胞内固

12、有的、能独立于染色体而自主复制，并被稳定遗传的一类核酸分子。天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（2）什么是质粒的不相容性及其机制；不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群。机制：两种含有不同复制子结构的质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。两种含有相似复制子结构的质粒，在复制时受同一种拷贝数控制系统的控制而产生竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期

13、中更具优势，并逐步将另一质粒“稀释”淘汰。（3）根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型（严紧型和松弛型），其中氯霉素的作用（蛋白质合成抑制剂，使染色体DNA合成受阻，松弛型继续扩增，极大提高拷贝数）；根据是否可以在细胞间转移，质粒可以分为（结合型和非结合型）；（4）质粒的性质自主复制性（质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制）、不相容性、可转移性（5）一个合格质粒的组成要素1.具有复制起始位点（Ori）或整合位点2.具有两种易被检测的选择性标记（抗生素抗性基因）3.具有多种限制酶的单一识别位点（多克隆位点MCS）4.具有尽可能小的相对分子质量5.属于松弛型复制6.属于非传递型质粒7.具有较高的外源DNA装载能力8. P/E（Promoter/Enhancer）：启动子/增强子9. T（Terminator）：终止信号10. poly（A）加尾信号：稳定mRNA（6）如何阅读质粒图谱（7）重要的大肠杆菌质粒载体pBR322松弛型复制/氯霉素可扩增/拷贝数每细胞50-100 /用于基因克隆 pUC18/19拷贝数2000-3000/cell装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ（E.coli的lacZ基因的5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O）用于基因克隆和测