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胡黄连译文

印度胡黄连标准化提取物对实验性非酒精性脂肪肝病的研究

摘要

作为一个中间代谢的主要器官，肝脏接触到各种代谢性损害，由于疾病和​​外源性物质即抗胰岛素（IR）药物，毒素，微生物产品等。

这些代谢损害，包括肥胖和2型糖尿病的后果之一是非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的发展。

最近NAFLD的患病率以惊人的速度增加，迫使我们需要制定一个该疾病的适当动物模型，从而开展有效的干预措施。

在这项研究中，我们已经开发了新的NAFLD大鼠模式，呈现出类似于人类疾病的几个关键特性。

雄性大白鼠用30％的高脂肪食物-黄油饲养2周诱发脂肪肝。

胡黄连的水醇提取物有助于研究在肝脏中的脂肪变化的可能逆转。

提取物给予两个剂量200mg/kg和400mg/kg，每日口服两次，为期4周。

有3个对照组，正常饮食组，HFD组，水飞蓟素（保肝药）与HFD组。

组织病理学显示，胡黄连提取物与高脂HFD对照组相比引起肝脏脂肪浸润（mg/g）的逆转，并降低肝脂量（mg/g），（200mg/kg的为38.33±5.35；400mg/kg的为29.44±8.49，高脂对照组肝组织为130.07±6.36mg/g，P<0.001）。

与已知的保肝药水飞蓟素的标准剂量相比，胡黄连在400mg/kg剂量时降低肝脏脂肪含量更为显著，（水飞蓟素组57.71±12.45mg/kg，400mg/kg的P.kurro组29.44±8.49，P<0.01）。

代谢综合征和脂肪肝的患病率增加，应通过反向药理路径调查胡黄连，将其作为一个潜在的药物治疗NAFLD，应进行必要的安全性研究和假定的活性成分浓度的处方研究。

简介

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）现在已经成为一个全球性的健康挑战。

1980年，路德维希等，对非酒精性患者肝脏活检发现脂肪浸润。

[1]后来在糖尿病（DM）和肥胖者身上观察到NAFLD。

在2型糖尿病患者中，[2,3]75％患有NAFLD。

[4]在肥胖者中，脂肪肝和肝纤维化是非常普遍的。

[5]事实上，DM在非酒精性脂肪肝与肝有关的死亡数中是一个独立危险因素[6]。

肥胖与糖尿病往往伴随着胰岛素和脂质代谢失调。

高胰岛素状态，潜在的肝毒性的脂肪酸可导致脂肪肝。

肥胖本身是NAFLD的危险因素：

内脏脂肪是脂肪肝的预测[7]内脏脂肪量的减少也被证明可减少肝脏胰岛素耐受性。

载脂肝细胞可以储存非极性肝毒性药物。

随后的氧化损伤的易感性，导致脂质过氧化和不饱和酮，醛。

后者可导致肝坏死，增强纤维化。

从一个简单的脂肪肝到脂肪性肝炎和纤维化。

肝硬化和/或肝癌可以是最终的并发症。

[8]

在印度，2000年约有3200万糖尿病患者，预计到2025年会达到6990万。

在这种情况下，脂肪肝将承担惊人的比例。

[4]代谢综合征除内脏型肥胖，高血压，血糖代谢障碍和血脂异常外还包括NAFLD。

[5-7]潜在的胰岛素抵抗（IR），氧化应激和炎症细胞因子是脂肪性肝病和脂肪性肝炎的起因[5,9,10]。

目前公认的是IR甚至在血糖正常体重正常的NAFLD患者身上发现。

NAFL及其并发症的范围变宽，对疾病的管理是挑战。

熊去氧胆酸，氯贝丁酯，吉非贝齐，维生素E，二甲双胍，甜菜碱已被推荐。

但这些都不是决定性有效的，需要良好对照的临床试验。

对使用禁食，饮食减少，小肠旁路等方法治疗肥胖对肝脏形态的影响[11]进行了研究[12]。

在印度保肝药用植物及其制剂传统上被用于预防和治疗多种肝脏疾病。

胡黄连已普遍用于治疗黄疸病。

[13]这种植物在各种肝毒性动物模型中如四氯化碳，D-半乳糖，对乙酰氨基酚，和硫代乙酰胺肝已被证明是保肝药[14-17]。

在狗和人类的胆瘘模型中也被证明是胆液排泄增多剂[18]。

在病毒性肝炎患者的双盲试验中发现，胡黄连根茎粉末是保肝药[19]。

此前，一种常用的草药配方-含有50％的胡黄连发现其在病毒性肝炎双盲试验中也有效[20]。

因此认为在NAFLD动物模型中研究胡黄连是可取的。

水飞蓟是在肝病治疗上研究最多的植物。

水飞蓟素对肝组织具有显著的抗炎作用。

一些研究已经证明她有多种抗炎作用，包括稳定肥大细胞，中性粒细胞迁移的抑制作用，和枯氏细胞抑制[21-25]。

在目前的研究中它用来做对照。

投入重大努力创建一个非酒精性脂肪肝动物模型。

材料与方法

化学制品

胡黄连苷由中央药物研究所（CDRI）提供，勒克瑙。

水飞蓟素是从美国西格玛化工有限公司购买。

其他所用试剂均为分析纯。

研究中血脂检测和肝功能检查用到的生化试剂盒，胆固醇（CHO细胞），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白（HDL），丙氨酸转氨酶（ALT），碱性磷酸酶（ALP）在当地购买。

生化分析仪用于所有生化指标的估计。

植物材料

药用植物P.kurroa被鉴定，从喜马拉雅地区收集其根茎。

它在Zandu制药工程私人有限公司被验证和标准化，该公司使用这种植物已经有几十年的历史。

生药学，标记和其他特点，是按照世界卫生组织的指引。

凭证标本存放在自己的植物标本馆。

植物提取物的制备

胡黄连的根茎经过适当的清洗后，用乙醇-水（50:

50）进行索氏提取。

每次提取三次，每次4个小时。

蒸馏提取物的总滤液。

滤液最终经喷雾干燥生成粉状。

提取率为33.95％W/W。

胡黄连的水醇提取物（HAE）储存在真空干燥器中。

在实验过程中，动物给药前粗提取物的适当等份要用羧甲基纤维素（CMC）稀释。

实验动物

雄性大白鼠，在M/S自交系。

取得实验的空隙后从SNDT大学制度动物伦理委员会采购。

体重200-250g的动物被饲养在实验室均衡的饮食和自由饮水条件下。

温度保持在20±2℃，湿度为65-70％，日/夜循环（12h/12h）。

一批“Amul”新鲜黄油在市场上购买，是用于研究的HFD。

实验设计

建立非酒精性脂肪肝动物模型和评估P.kurroaHAE的作用的方法。

动物16小时禁食过夜，自由饮水。

节食期结束时，轻度麻醉下从后眼窝血管收集血液，以评估基础值，TG，CHO，高密度脂蛋白（HDL），ALT和ALP。

动物随机分为五组（每组6只）。

第1组：

动物自由进食2周。

2周后，伴随相同的饮食口服0.5mlCMC4周。

第2组：

动物口服饲喂30％HFD6周。

第3-5组：

动物喂食30％的HFD2周。

2周后，随着30％的高脂饮食，分别给予水飞蓟素50mg/kg（3组），HAE胡黄连200mg/kg（4组），或HAE胡黄连400mg/kg（5组）持续4周。

动物的体重，每周称一次。

隔夜空腹生化检验后的第2周和第6周结束时再次进行眼窝取血。

在治疗期结束后，动物断头处死，对肝脏组织病理学和脂肪含量进行评估。

生化和组织病理学条件的评估解剖肝脏，并立即用冰冷盐水冲洗。

肝脏称重，并进行了总检查。

然后被储存在10％福尔马林中，随后用苏木精和伊红（H和E）染色处理用于病理研究。

肝脏结构中的损伤以变性，坏死，纤维化的形式产生，分级如下：

变性Gr0，不变质;Gr1，每个领域有少数脂肪细胞;Gr2，每场有100多个脂肪细胞;Gr3，每个病变有一或两行的脂肪细胞;Gr4，广泛的小叶中心和中间带状脂肪气球样变性。

坏死Gr0，无坏死;Gr1，小叶中心坏死或1到2个细胞病变;Gr2，中枢桥接坏死;Gr3，大量的小叶中心坏死，Gr4，大规模的小叶中心坏死和桥接中心静脉的坏死组织。

纤维化Gr0，无纤维化;Gr1，中心坏死，轻度门静脉周边纤维化;Gr2，只是入口区域存在纤维组织和1级提到的其他变化。

Gr3，纤维组织影射周围肝实质；Gr4通过影射纤维组织形成假小叶。

使用Folch方法评估肝脏脂质含量。

肝功能测试-[26]，TG，CHO，高密度脂蛋白，ALT，ALP使用标准的试剂盒的分光光度法进行。

统计分析

使用单向差分析（ANOVA）检验进行统计分析，以评估控制组，高脂饮食组和干预组之间的统计学意义。

测试生化值的平均值±标准误差之间的差异，看是否有意义。

结果

未加工的植物材料和胡黄连水醇粗提取物的植物化学成分分析

胡黄连原材料的总灰分含量估计为4.53％。

天然胡黄连材料中苦味素占主导（20％），而P.kurroaHAE显示6.54％苦味剂。

[27]

通过菌落形成单位（CFU/10克）对大肠杆菌，葡萄球菌，链球菌，沙门氏菌，霉菌和酵母菌进行了微生物分析。

干预提取物远离微生物。

研究之前，根据世界卫生组织的标准对选定的胡黄连的质量和纯度标准化进行确认。

P.kurroaHAE对高脂肪（30％）饮食的NAFLD大鼠模型的作用

对对照组的肝脏大体检查显示正常的颜色淡红，而高脂饮食组呈苍白色。

对照组的肝组织病理显示正常结构，而在高脂饮食对照组中观察颗粒变性和轻度多病灶性胆管增生的脂肪浸润。

注意到，胡黄连治疗的组，像水飞蓟素组，显示最小的肝损伤和肝组织结构和架构的明显保存。

[图2a-d]

在研究过程中，组之间的体重或肝量均没有显著性差异。

尽管在肝脏重量上缺乏变化，高脂饮食模型组肝组织脂质含量与标准水飞蓟素组（57.71±5.08mg/g）相比显著上升[图3]为（130.07±2.6mg/g）。

没有进食任何HFD的对照组脂肪含量为69.2±3.98mg/g。

两个P.kurroa治疗组均显示其肝组织中的脂肪含量减少。

400mg/kgP.kurroa治疗组（29.44±3.47毫克/克）比水飞蓟素组脂肪含量减少更多（P<0.01），虽然水飞蓟素组与200mg/kgP.kurroa组相比变化并不显著。

如图4所示是各组的血清胆固醇水平。

对照组血清胆固醇呈现与年龄有关的逐步增加，如图3所示。

在高脂饮食组，与年龄有关的血清胆固醇增加进一步放大。

与基值相比，在第2周和第6周胆固醇值显著增加（分别为38.3±1.75，65.13±2.04，84.97±2.4mg/dl）。

在水飞蓟素组，第二周的胆固醇水平与基值（34.82±2.61mg/dl）相比显着增加（61.45±2.62mg/dl）。

然而，到第6周时水飞蓟素组年龄相关的血清胆固醇水平的上升与HLD组相比已经减弱（53.9±1.62mg/dl）。

同样HAE胡黄连200mg/kg治疗组在第6周结束时的值（49.08±1.87mg/dl）与第二个星期值（63.21±8.39mg/dl）相比进一步减少。

然而，在HAEP.kurroa400mg/kg治疗组，没有观察到血清胆固醇值衰减（59.52±2.7mg/dl）。

图5中所示为所有组的血清甘油三酯水平。

在对照组看到血清TG与年龄有关的增加，从基础到第2周和第6周（41.28±5.03，82.07±7.24，71.1±5.62mg/dl）。

在高脂饮食组，与基础值56.55±4.3mg/dl相比，与年龄有关的血清TG水平增加在2周（393.99±56.6mg/dl）和第6周（487.75±70.94mg/dl）显著放大。

然而，在水飞蓟素组，与年龄有关的TG水平在第6周衰减（基值-42.46±2.63mg/dl，第二周-223.82±22.63mg/dl，第6周-133.52±14.7mg/DL）。

在胡黄连治疗组，第6周与第二周的值相比也有所下降，尽管效果并不显著。

图6所示为各组高密度脂蛋白水平。

在对照组，分析第2周和第6周的HDL值分别为37±1.86和42.5±3.38mg/dl。

然而，在HFD组第6周时观察到HDL水平显著下降（26.5±1.1mg/dl）。

在水飞蓟素组和HAE胡黄连200mg/kg组，在干预的第6周时HDL水平没有显著变化。

然而，在HAE胡黄连400mg/kg组，在第6周观察到高密度脂蛋白水平并没有显示出下降，可与在控制组看到的相媲美。

经过两个星期的诱导期，在高脂饮食组和水飞蓟素治疗组观察到ALT水平显著上升。

高脂饮食模型和水飞蓟素组，在研究的第二个星期ALT水平（103.43±16.04U/L，102.65±19.45U/L）与控制组（46.95±3.14U/L）相比显著增加。

第6周，高脂组的ALT值进一步增加（126.65±14.98U/L），而水飞蓟素组ALT值水平降低（73.65±3.89U/L）。

HAEP.kurroa200和400mg/kg组显示剂量依赖的结果（51.81±2.13和42.86±2.35U/L）如[图7]。

HFD，水飞蓟素组和胡黄连200和400mg/kg组在第2周时ALP水平（分别为1408.08±233.74,1563.5±189.23U/L,1417.10±253.58,1192.05±718.18U/L）与对照组（402.23±22.01U/L;P<0.001）相比明显提高。

研究结束后HFD组的ALP值（2136.17±41.01U/L）与第2周相比显著增加。

尽管在第6周时水飞蓟素组的ALP水平降低，但该值也没有标准化。

然而在两个P.kurroa治疗组ALP水平不仅降低，还回归到正常值。

如[图8]

讨论

NAFLD是代谢综合征的一个组成部分，综合征包含中央肥胖，高血压，空腹血糖受损（IFG），糖耐量减低（IGT），高甘油三酯血症，低高密度脂蛋白。

[28]代谢综合症是II型糖尿病，冠状动脉疾病，脑血管疾病的一个危险因素[29]。

NAFLD在胰岛素抵抗和糖尿病的发生中也有牵连[30-32]。

后者的条件已经达到全球流行病的程度。

印度拥有世界上最高的糖尿病发病率。

然而，NAFLD在印度次大陆患病率的流行病学数据不足。

但临床印象和一些研究表明，该病患病率较高[33,34]。

NAFLD的频谱很宽，从肝细胞中简单的和可逆的脂肪堆积，到最终导致不可逆转的纤维化，甚至终端肝硬化或癌症。

因此，治疗和预防该疾病存在挑战和机遇。

虽然减重，熊去氧胆酸，氯贝丁酯，吉非贝齐，维生素E，二甲双胍，甜菜碱已作为治疗方式被建议，但他们都不是很有效[35-40]。

古老的阿育吠陀文学和现有的基础和临床研究已经确定了几个具有保肝效果的印度药用植物/配方[14,20,41]。

本研究的目的是调查P.kurroa的一个标准化提取物高脂饮食诱导的脂肪肝动物模型的保肝潜力，显示肝脏病变，血脂和酶变化的逆转。

水飞蓟素，是从水飞蓟种子和果实中提取的一种木质素，被用来作为阳性对照。

P.kurroa的根和根茎提取物对不同的肝毒性模型表现保肝活性[42-44]。

P.kurroa含有环烯醚萜苷（包括胡黄连苷I，II，III，pikuroside，胡黄连糖甙和6-阿魏酰梓醇）葫芦素，草夹竹桃甙，香夹蓝乙酮和其他有机酸如香草酸和肉桂酸等。

这是中肯的，要注意tiktarasa,lagurukshaguna,andkatuvipaka的特性。

基于这些特性，可以预见其对血脂尤其是与血脂异常有关的药效活性。

[45]胡黄连苷I很早已被证明对几种肝毒性模型有效[43]。

在本研究中标记和选定的药用植物的药理学活性化合物用色谱方法进行了论证。

在柬埔寨发展资源研究所通过薄层色谱法，高效薄层和高效液相色谱法对标准化合物研究，得到HAEP.kurroa的指纹图谱。

纯标准实验用提取物的色谱身份确认了提取方法，并给予相关的提取物假定活性成分的介入研究。

用高效液相色谱法检测标准化提取物中的胡黄连苷I（数据未显示）。

NAFLD的动物模型的发展是一项艰巨的任务。

对于选定的药用植物的介入研究，模型必须简单，适合和经济。

有研究表明，单不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸（MUFA和SFA）通过增加脂肪生成导致肥胖[46]因此，一种常用的动物脂肪形式-黄油–因为富含饱和脂肪酸被选中。

由不同浓度的黄油组成的HFD被用来诱导大鼠NAFLD模型，其中发现30％的高脂肪适合本研究。

目前的动物模型在临床病理学和生化变化方面显示与临场NAFLD的实体近似。

用其他肝毒性药物发展非酒精性脂肪肝动物模型的较早尝试不太成功（未发表资料）。

在本研究中，我们已经表明，30％的HFD显著增加了肝组织的脂肪含量，而不会影响体重或肝脏重量。

同样观察到血脂水平提高。

在这个模型中观察到血清ALT和ALP值-NAFLD的一个重要特征–增加。

Pan等，已经表明，高脂饮食可以引起脂肪肝大鼠的氧化应激[47]。

NAFLD的病理检查结果范围从脂肪变性，肝细胞膨胀，轻微小叶内炎症，和窦周胶原沉积。

[48]在本研究中使用大鼠（30％）高脂模型，肝段的组织病理学显示脂肪的变化。

由于这种模型产生的肝脏病变和血液化学变化类似于NAFLD，因此采用该模型研究选定的药用植物提取物的干预作用。

各组体重的变化表现出与年龄有关的增加，但各组之间的差异不显著。

尽管体重增加减少，与控制组或饮食模式相比，植物组中获取的体重值没有统计学意义。

肝脏重量表示为g/100g的体重，在控制组，饮食模式和植物干预组之间没有表现出任何的显着性差异。

在HFD组观察到肝脏脂肪含量增加了两倍，证明该模型的适用性。

水飞蓟素组的肝脏脂肪含量与饮食模型组相比显著减少。

P.kurroa干预组显示肝脏脂肪含量随剂量增加而减少。

组织病理学研究通过平行的和显著的形态正常化肝脏架构证实了脂肪含量减少和肝细胞的脂肪浸润明显减少的上述声明。

两组P.kurroa和其有效成分被证明有促胆汁分泌活性，并增加胆汁的产生[18]。

目前诱导治疗降低血清胆固醇和脂肪肝，主要归因于胆汁盐螯合剂如树脂-消胆胺。

树脂结合胆盐不进入肝肠循环，这有助于胆盐进一步分泌胆汁，胆固醇的分解产物。

P.kurroa有效成分的降脂作用机制有待探索。

脂肪变形发展成脂肪性肝炎，植物的抗炎作用可能是一个额外的好处[49]。

水飞蓟素和HAEP.kurroa组与饮食模型组相比均显示明显的降胆固醇作用。

第二个星期时胆固醇的明显上升，不体现在高密度脂蛋白的变化上。

这一发现表明，在30％高脂饮食的影响下，应该以具体的脂蛋白为特点。

到第6周，HFD组与对照组相比，高密度脂蛋白显著减少（P<0.01）。

然而，有趣的是，400mg/kgP.kurroa组HDL值为40.27±2.85mg/dl与HFD组（26.50±1.1mg/dl）相比显著上升。

P.kurroa组的值与第6周对照组值接近。

这些结果需要用其他高脂血症和动脉粥样硬化模型进一步深入研究，因为难以获得高的高密度脂蛋白水平。

低HDL值是冠心病的重要危险因素[50]。

干预剂量和水飞蓟素与HFD组相比显著降低了TG水平。

转氨酶升高，反映肝细胞坏死[51]。

尤其ALT是肝坏死的更具体的指标。

与HFD组相比，水飞蓟素组ALT水平显著降低。

然而，观察到P.kurroa的效果更有效，400mg/kg剂量组与对照组的值相比降低了ALT水平。

这一结果需要在体外肝细胞培养和其他轻度、​​中度肝损伤模型中进一步追踪。

这种植物的抗炎活性，也应面对体内坏死引起炎症的程度评估。

特别是，第一阶段蛋白质和促炎细胞因子的释放，引起细胞死亡，应被研究[52]。

ALP反映胆汁淤积的损害，可能会被肝毒性药物诱发[53,54]。

虽然在HFD组肝活组织检查时观察到肝内胆汁淤滞，但在治疗组有所衰减。

P.kurroa组这种胆汁淤积的清楚以及低的ALP水平证实该植物具有保肝活性。

两个P.kurroa剂量组在第6周时血清ALP水平明显低于水飞蓟素组。

P.kurroa在两个剂量水平ALP均显示高度减少。

几乎接近ALP的基础值，该值呈剂量–响应关系。

应进行胆汁淤积模型的进一步研究。

结论

目前的研究已逐渐形成了一种合适的带有几个特征的NAFLD动物模型，与在人类身上看到的一一对应。

P.kurroa植物标准化提取物的干预，使NAFLD的几个特征回归，如肝组织脂肪含量，脂肪浸润，降血脂活动，和胆汁郁积减少的形态回归。

目前以反向药理学为基础的管理NAFLD的药物开发研究应进一步追踪。