mES培养.docx

mES培养.docx

《mES培养.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《mES培养.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

mES培养

干细胞技术支撑平台简介

中国科学院生物化学与细胞生物学研究所干细胞技术支撑平

台（StemCellSupportPlatform）成立于2007年1月。

主管机构为中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

干细胞技术支撑平台旨在提供干细胞培养和研究相关的资源、材料和技术，促进我国干细胞研究的发展。

（一）我们的任务

★为致力于干细胞研究的科研工作者提供资源、材料和专业技术支持

★与相关单位合作促进干细胞在基础生物学研究、药物研发、临床应用等领域的发展

★加强干细胞研究领域的国内外交流

（二）我们的服务

★饲养层细胞、小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞★不同分化条件、不同分化阶段的细胞或细胞裂解物

干细胞技术平台

★饲养层细胞制备、小鼠和人胚胎干细胞培养和分化相关技术培训

★小鼠胚胎干细胞建系、全能性鉴定技术培训

★饲养层细胞、小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞培养相关试剂

★小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞全能性鉴定的全套一抗、二抗试剂盒

★小鼠胚胎干细胞培养、自主分化用的各类生长因子

★小鼠胚胎干细胞三胚层分化的全套免疫荧光染色Marker试

剂盒

★支原体检测服务及检测试剂盒

★小鼠胚胎干细胞电转

★普通细胞电转

★内毒素检测

★开展发育生物学及干细胞研究前沿的相关讲座

★项目合作

（三）我们的队伍

负责人丁小燕教授研究员，博士生导师

工作人员刘敏英

干细胞技术平台

徐兰周桢宁杨科吕岳徐鹏董娟

（四）联系我们

联系人：

董娟

中国科学院上海生命科学研究院

生化细胞所干细胞技术支撑平台

上海市岳阳路320号老生化大楼（41号楼），邮编200031

StemCellSupportPlatform

InstituteofBiochemistryandCellBiology

ShanghaiInstituteforBiologicalSciences

ChineseAcademyofSciences

Room733,OldBiologyBuilding,No.320YueyangRoad,

Shanghai200031,P.R.China

Tel:

+86-21-54921358

Fax:

+86-21-54921439

E-mail:

dongjuan@sibs.ac.cn

W:

http:

//www.sibcb.accn/cp13-2.asp

干细胞技术平台

学员须知

1.提前半小时打开洁净室风机、层流罩风机和紫外灯。

2.进入操作室前按规定换鞋，穿好反穿衣，带上帽子、口罩、手套

3.进出洁净室时，必须先关闭前一扇门再开另一扇门，以此类推。

4.每次进出洁净室请在表格上做好登记，包括时间、所用的耗材、领用的培养液、试剂和细胞。

5.最后离开操作室的人员请熄灭酒精灯，关闭层流台风机，打开紫外灯，关闭显微镜电源，关掉照明灯。

6.学员轮流值周做清洁工作。

7.发生仪器故障或有任何疑问请及时联系管理员。

8.请学员爱护公共财产。

人为原因造成公用仪器损坏的，将追究当事人的责任。

9.具体安排及注意事项见细胞房内张贴的通知。

培训指导人员：

徐兰

720室

电话：

54921412

138********

干细胞技术平台

饲养层细胞制备

小鼠胚胎成纤维细胞制备、冻存

一.取得小鼠胚胎

1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（3）：

2母（早）比例合笼。

2.每天早上观察母小鼠阴道口。

有乳白色或蛋黄色冻胶状物（阴道

栓）即确定为怀孕。

见栓当天上午定为怀孕的0.5d。

3.取怀孕12.5〜14.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫。

4.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。

5.取出整个子宫，置于有PBS（磷酸盐缓冲液）的平皿内。

用PBS洗涤三次,弃除表面残余血迹。

6.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。

干细胞技术平台

7.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次。

8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平

皿内，用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。

取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）

1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪（切）成1mm3以下的碎块，吸置于离心管内。

2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟

3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化

4.离心1000转，5分钟

5.弃掉上清，加适量培养液，反复吹打20次

6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞

7.置37C、5%CO2、饱和湿度培养箱培养

8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可1:

3-1:

6传代

9.吸弃培养液上清

10.PBS（不含钙镁）冲洗两次

11.加0.25%胰酶-0.02EDT消化

12.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时，用移液管吹打冲洗瓶底5-6次

13.即刻加MEF培养液终止消化

14.1000转，5分钟离心。

吸弃上清

干细胞技术平台

15.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各T75中。

完成传代

16.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每次传代过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失

17.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时,杂细胞逐渐减少。

小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联，形态不典型。

三.MEF的冻存

1.当细胞90%-100%融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻。

2.处理方法同二的9-14,每75cm2的细胞加3ml冻存液重悬细胞。

3.每个冻存管编号加1ml细胞悬液。

4.置入程序降温盒-80°C过夜，放入液氮长期保存。

饲养层细胞制备

1.取新的培养瓶，加0.1%Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前吸掉Gelatin溶液。

2.取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素

（MitomycinC）混匀。

3.置培养箱中3小时。

4.吸弃废液。

5.用DPBS洗5遍。

干细胞技术平台

6.处理方法同二11—14。

7.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0X04/cm2（MEF）

铺在Gelatin处理过的培养瓶上

8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁

9•铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其

全能性

小鼠胚胎干细胞培养

小鼠胚胎干细胞复苏：

1.操作前把培养液在37C水浴中温热

2.从液氮中取出一支冻存管的D3细胞，放入37C水浴中晃动，直

到只剩下小冰晶

3.吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量培养液的15ml离心管中，离

心1000rpm,5min

4.吸弃上清液，加4—6ml培养液，吹打悬浮。

5.重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡

6.转移到1个已经铺好饲养层的25c*Flask中培养

7.每天换液。

小鼠胚胎干细胞传代:

干细胞技术平台

1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆的大小和密度而定。

2.吸弃废液。

3.用PBS（不含钙镁）轻轻冲洗两遍。

4.加0.5—1.0ml的胰酶（0.25%）—EDTA（0.02%）溶液至培养瓶，

左右晃动，使胰酶覆盖整个瓶底，消化细胞。

5.在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要1—2min）。

6.加适量（4—5ml）含血清的培养液终止消化。

建议专门配制只含85%DMEM12430+15%DFBS的终止液，来终止胰酶的作用即可，因为如果用mES培养液，其中还含有LIF、L-Glu、NEAA、（—巯基乙醇这些昂贵的成分，而终止胰酶主要是靠血清，所以，为了节约起见，可专门配制终止液。

7.多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。

8.加足量的培养液，吹打混匀，细胞液分装到各铺好MEF的

25cm2Flask中，一个Flask加5—6mlES培养液。

9.放入培养箱中。

10.每天换液。

传代比例：

1:

4—1:

10

小鼠胚胎干细胞冻存:

1.按传代的方法把细胞消化下来，制成细胞悬液。

干细胞技术平台

2.1000转/5分钟离心。

3.弃上清，逐滴加已经预冷的冻存液并不断摇动混匀。

4.分装到冻存管中，标记。

5.将冻存管置程序降温盒，—80C过夜，转入液氮。

小鼠胚胎干细胞悬滴法形成拟胚体（embryonicbodies,EB）

1.从冻存状态复苏出来的小鼠胚胎干细胞，在饲养层上正常培养2天左右

2.用胰酶消化下来，按照正常的传代比传至只铺有0.1%明胶

的器皿上，培养18-36小时，可以近似认为去除了饲养层的干扰。

少数分化的ES以及微量存活的滋养层细胞对后续实验影响很小。

3.将已经去除了饲养层的未分化的小鼠胚胎干细胞用胰酶消

化下来，计数，用分化培养液稀释到大约在10-15万个细胞/毫升的浓度，进行悬滴。

4.以20ul—滴，将每滴悬液均匀的用枪滴至平皿的上盖内表面。

注意悬滴间距不宜太近或太远。

滴满后的上盖迅速扣至已经事先加入少量PBS的下盖上。

随后小心放置培养箱中。

5.48小时后，在每一个悬滴液体中均可以用肉眼看见一个白

色颗粒状物体，此即为初期拟胚体。

用枪头可以小心地将拟胚体吸出，进行悬浮或贴壁培养。

干细胞技术平台

干细胞技术平台

附录1干细胞平台可提供的细胞

小鼠胚胎干细胞（Mouseembryonicstemcell,mES）

细胞系

小鼠品系

基因

修饰

来源

培养

方法

参考文献

R1/E

129X1x

129S1

无

ATCC

附1

MatiseM,etal.Productionoftargetedembryonicstemcellciones.In:

GeneTargeting:

APracticalApproach.Oxford:

OxfordUniversityPress;1999,101-132.

NagyA,etal.Derivationofcompletelycell

culture-derivedmicefromearly-passageembryonic

stemcells.Proc.Natl.Acad.

Sci.USA8424-8428,1993.PubMed.

R1/a3

129X1x

129S1

WNT

GFP

报告

ATCC

附1

干细胞技术平台

基因

D3

129S2/SvPas

无

ATCC

附1

DoetschmanTC,etal.Theinvitrodevelopmentofblastocyst-derivedembryonicstemcelllines:

formationofvisceralyolksac,bloodislandsandmyocardium.J.Embryol.Exp.Morphol.87:

27-45,1985.PubMed:

389743922928:

WilliamsRL,etal.Myeloidleukaemia

inhibitoryfactormaintainsthedevelopmentalpotentialofembryonicstemcells.Nature336:

684-687,1988.PubMed:

3143916

E14

无

ATCC

附1

CE3

129S2/SvPas

表达

GFP;

抗嘌呤霉

ATCC

附1

MatiseM,etal.Productionoftargetedembryonicstemcellciones.In:

editors.GeneTargeting:

APractical

干细胞技术平台

素

Approach.Oxford:

OxfordUniversityPress;1999,101-132.

AdamsLD,etal.Doubleloxtargetingforneuralcelltransgenesis.BrainRes.Mol.BrainRes.110:

220-233,2003.

饲养层细胞（Mouseembryonicfibroblasts,MEF）

名称

描述

小鼠品系

抗性基因

来源

MEF

（KMB）

小鼠胚胎成

纤维细胞

昆明白

无

自制

MEF（G418）

小鼠胚胎成

纤维细胞

抗G418

自制

MEF（DR4）

小鼠胚胎成

纤维细胞

抗G-418,嘌

呤霉素，潮霉素，抗6—硫鸟嘌呤

ATCC

MEF（CF1）

小鼠胚胎成

纤维细胞

CF-1,non-inbredmousestrain

无

自制

干细胞技术平台

（non-agoutialbino）fromCarworthFarms

ICR

小鼠胚胎成

纤维细胞

ICR

无

自制

STO

小鼠胚胎成

纤维细胞

SIM（Sandos

InbredMice）

无

自制

更详细信息请查询网页

干细胞技术平台

附录2

培养液配方

MEF培养液

DMEM

GIBCO12430

FBS

BIOCHROM

S0615

10%

L-glu

GIBCO25030

2mM

NEAA

11140

100*（0.1mM）

mES培养液

DMEM

GIBCO12430

FBS

BIOCHROM

S0615

15%

NEAA

GIBCO

11140-050

0.1mM

L—glu

GIBCO25030

2mM

2-mercaptoethanol

GIBCO21985

0.1mM

LIF

CHEMICON

ESG1107

1000U/ml

mES冻存液

DMEM

GIBCO12430

干细胞技术平台

FBS

BIOCHROMS0615

DMSO