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1、mES培养干细胞技术支撑平台简介中国科学院生物化学与细胞生物学研究所干细胞技术支撑平台（Stem Cell Support Platform）成立于2007年1月。主管机构为中科 院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。 干细胞技术支 撑平台旨在提供干细胞培养和研究相关的资源、 材料和技术， 促进我 国干细胞研究的发展。（ 一 ） 我们的任务为致力于干细胞研究的科研工作者提供资源、材料和专业技术 支持与相关单位合作促进干细胞在基础生物学研究、药物研发、临 床应用等领域的发展加强干细胞研究领域的国内外交流（二） 我们的服务 饲养层细胞、小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞 不同分化条件、不同分化

2、阶段的细胞或细胞裂解物干细胞技术平台饲养层细胞制备、小鼠和人胚胎干细胞培养和分化相关技术 培训小鼠胚胎干细胞建系、全能性鉴定技术培训饲养层细胞、小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞培养相关试剂小鼠胚胎干细胞、人胚胎干细胞全能性鉴定的全套一抗、二 抗试剂盒小鼠胚胎干细胞培养、自主分化用的各类生长因子小鼠胚胎干细胞三胚层分化的全套免疫荧光染色 Marker试剂盒支原体检测服务及检测试剂盒小鼠胚胎干细胞电转普通细胞电转内毒素检测开展发育生物学及干细胞研究前沿的相关讲座项目合作（三）我们的队伍负责人 丁小燕教授 研究员，博士生导师工作人员 刘敏英干细胞技术平台徐兰 周桢宁 杨科 吕岳 徐鹏 董娟（四）联系我们

3、联系人：董 娟中国科学院上海生命科学研究院生化细胞所干细胞技术支撑平台上海市岳阳路320号老生化大楼（41号楼），邮编200031Stem Cell Support PlatformInstitute of Biochemistry and Cell BiologyShanghai Institute for Biological SciencesChi nese Academy of Scie ncesRoom 733, Old Biology Building, No.320 Yueyang Road,Shanghai 200031, P.R. ChinaTel:+86-21-549213

4、58Fax:+86-21-54921439E-mail:don gjua n sibs.ac.c nW:http:/www.sibcb.acc n/cp13-2.asp干细胞技术平台学员须知1.提前半小时打开洁净室风机、层流罩风机和紫外灯。2.进入操作室前按规定换鞋，穿好反穿衣，带上帽子、口罩、手套3.进出洁净室时，必须先关闭前一扇门再开另一扇门，以此类推。4.每次进出洁净室请在表格上做好登记，包括时间、所用的耗材、 领用的培养液、试剂和细胞。5.最后离开操作室的人员请熄灭酒精灯，关闭层流台风机，打开紫 外灯，关闭显微镜电源，关掉照明灯。6.学员轮流值周做清洁工作。7.发生仪器故障或有任何疑问

5、请及时联系管理员。8.请学员爱护公共财产。人为原因造成公用仪器损坏的，将追究当 事人的责任。9.具体安排及注意事项见细胞房内张贴的通知。培训指导人员： 徐兰720室电 话： 54921412138*干细胞技术平台饲养层细胞制备小鼠胚胎成纤维细胞制备、冻存一.取得小鼠胚胎1.性成熟母小鼠与种公鼠按1公（3） ：2母（早）比例合笼。2.每天早上观察母小鼠阴道口。有乳白色或蛋黄色冻胶状物（阴道栓）即确定为怀孕。见栓当天上午定为怀孕的 0.5d。3.取怀孕12.514.5d母鼠，断颈处死，无菌条件下暴露子宫。4.用镊子提起近子宫颈端，分离子宫系膜，剪断子宫角。5.取出整个子宫，置于有PBS（磷酸盐缓冲

6、液）的平皿内。用PBS 洗涤三次,弃除表面残余血迹。6.沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，置于另一盛有 PBS的平皿内，充分洗涤，弃除表面红细胞。干细胞技术平台7.用小镊子撕破胎膜，取出胎鼠，弃除胎膜，用PBS洗涤三次。8.去除胚胎头部、内脏和四肢，将躯干部置于另一盛有PBS的平皿内，用PBS至少洗涤三次,充分弃除红细胞。取得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）1.用无菌眼科小剪刀或刮胡刀片将鼠胚躯干剪 （切）成1mm3以下 的碎块，吸置于离心管内。2.加适量胰酶，将离心管置于培养箱中10-20分钟3.取出离心管，反复吹打，加足量培养液终止消化4.离心1000转，5分钟5.弃掉上清，加适量培养

7、液，反复吹打 20次6.分装到T75中，一般每2个胚胎可以制成一个T75的原代细胞7.置37 C、5%CO2、饱和湿度培养箱培养8.待细胞长3-7天细胞互相重叠爬满整个培养瓶底时即可 1:3-1: 6传代9.吸弃培养液上清10.PBS （不含钙镁）冲洗两次11.加 0.25%胰酶-0.02EDT 消化12.在显微镜下观察，当少量细胞漂浮，贴壁的细胞层出现裂隙时， 用移液管吹打冲洗瓶底5-6次13.即刻加MEF培养液终止消化14.1000转，5分钟离心。吸弃上清干细胞技术平台15.加足培养液，吹打制成单细胞悬液，分装到各 T75中。完成传 代16.原代细胞中还有少量组织块未被充分消化，在以后的每

8、次传代 过程中要尽量制成单细胞悬液，组织块会逐渐消失17.原代细胞中混有一些杂细胞，一般传到第3代时,杂细胞逐渐减 少。小鼠胚胎成纤维细胞为梭状；但连成片时，细胞互相交联， 形态不典型。三.MEF的冻存1.当细胞90%-100%融合时，尤其细胞少量堆聚可冷冻。2.处理方法同二的9- 14,每75 cm2的细胞 加3ml冻存液重悬 细胞。3.每个冻存管编号加1ml细胞悬液。4.置入程序降温盒-80C过夜，放入液氮长期保存。饲养层细胞制备1.取新的培养瓶，加0.1% Gelatin溶液覆盖预处理30分钟，用前 吸掉Gelatin溶液。2.取需要处理的MEF细胞，以10ug/ml浓度加丝裂霉素(Mi

9、tomycin C )混匀。3.置培养箱中3小时。4.吸弃废液。5.用DPBS洗5遍。干细胞技术平台6.处理方法同二11 14。7.处理过的MEF加适量培养液重悬计数，以3.0 X04/ cm2( MEF)铺在Gelatin处理过的培养瓶上8.置培养箱中静置过夜，使其贴壁9铺好的饲养层在1-7天内有效，都可以支持mES生长并维持其全能性小鼠胚胎干细胞培养小鼠胚胎干细胞复苏：1.操作前把培养液在37C水浴中温热2.从液氮中取出一支冻存管的 D3细胞，放入37C水浴中晃动，直到只剩下小冰晶3.吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量培养液的 15ml离心管中，离心 1000rpm, 5min4.吸弃上清液

10、，加4 6ml培养液，吹打悬浮。5.重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡6.转移到1个已经铺好饲养层的25c*Flask中培养7.每天换液。小鼠胚胎干细胞传代:干细胞技术平台1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆的大小和密度而定。2.吸弃废液。3.用PBS （不含钙镁）轻轻冲洗两遍。4.加 0.5 1.0 ml 的胰酶（0.25%） EDTA（0.02%）溶液至培养瓶，左右晃动，使胰酶覆盖整个瓶底，消化细胞。5.在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要 1 2min）。6.加适量（4 5ml）含血清的培养液终止消化。建议专门配制只含 85%DMEM12430+15%DFBS的终止液，来终

11、止胰酶的作用即可， 因为如果用 mES培养液，其中还含有 LIF、L-Glu、NEAA、（ 巯基乙醇这些昂贵的成分，而终止胰酶主要是靠血清，所以，为 了节约起见，可专门配制终止液。7.多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。8.加足量的培养液，吹打混匀，细胞液分装到各铺好 MEF的25cm2Flask 中，一个 Flask 加 5 6mlES 培养液。9.放入培养箱中。10.每天换液。传代比例：1: 4 1: 10小鼠胚胎干细胞冻存:1.按传代的方法把细胞消化下来，制成细胞悬液。干细胞技术平台2.1000转/5分钟离心。3.弃上清，逐滴加已经预冷的冻存液并不断摇动混匀。4.分装到冻存管中，标记。5.

12、将冻存管置程序降温盒，80C过夜，转入液氮。小鼠胚胎干细胞悬滴法形成拟胚体(embryonic bodies, EB )1.从冻存状态复苏出来的小鼠胚胎干细胞，在饲养层上正常培 养2天左右2.用胰酶消化下来，按照正常的传代比传至只铺有 0.1%明胶的器皿上，培养18-36小时，可以近似认为去除了饲养层的 干扰。少数分化的ES以及微量存活的滋养层细胞对后续实 验影响很小。3.将已经去除了饲养层的未分化的小鼠胚胎干细胞用胰酶消化下来，计数，用分化培养液稀释到大约在10-15万个细胞 /毫升的浓度，进行悬滴。4.以20ul 滴，将每滴悬液均匀的用枪滴至平皿的上盖内表 面。注意悬滴间距不宜太近或太远。

13、 滴满后的上盖迅速扣至 已经事先加入少量PBS的下盖上。随后小心放置培养箱中。5.48小时后，在每一个悬滴液体中均可以用肉眼看见一个白色颗粒状物体，此即为初期拟胚体。用枪头可以小心地将拟 胚体吸出，进行悬浮或贴壁培养。干细胞技术平台干细胞技术平台附录1干细胞平台可提供的细胞小鼠胚胎干细胞(Mouse embryonic stem cell, mES )细胞系小鼠品系基因修饰来源培养方法参考文献R1/E129X1 x129S1无ATCC附1Matise M, et al. Production of targeted embryonic stem cell cion es. In: Gene T

14、arget ing: A Practical Approach. Oxford: Oxford Uni versity Press; 1999, 101-132.Nagy A, et al. Derivation of completely cellculture-derived mice from early-passage embry onicstem cells. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 8424-8428, 1993. PubMed.R1/a3129X1 x129S1WNTGFP报告ATCC附1干细胞技术平台基因D3129S2/SvPas无ATCC附1Doe

15、tschma n TC , et al. The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: formation of visceral yolk sac, blood isla nds and myocardium. J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45, 1985. PubMed: 3897439 22928: Williams RL , et al. Myeloid leukaemiainhibitory factor maintains the develo

16、pme ntal pote ntial of embryonic stem cells. Nature 336: 684-687, 1988. PubMed: 3143916E14无ATCC附1CE3129S2/SvPas表达GFP;抗嘌 呤霉ATCC附1Matise M , et al. Producti on of targeted embryonic stem cell ciones. In: , editors. Gene Targeti ng: A Practical干细胞技术平台素Approach. Oxford: Oxford Uni versity Press; 1999, 1

17、01-132.Adams LD , et al. Double lox targeting for neural cell tran sge nesis. Brain Res. Mol. Brain Res. 110: 220-233, 2003.饲养层细胞(Mouse embryonic fibroblasts, MEF )名称描述小鼠品系抗性基因来源MEF(KMB )小鼠胚胎成纤维细胞昆明白无自制MEF( G418)小鼠胚胎成纤维细胞抗 G418自制MEF (DR4)小鼠胚胎成纤维细胞抗G-418,嘌呤霉素，潮 霉素，抗6 硫鸟嘌呤ATCCMEF (CF1)小鼠胚胎成纤维细胞CF-1, n

18、on-i nbred mouse strain无自制干细胞技术平台(non-agouti alb ino) from Carworth FarmsICR小鼠胚胎成纤维细胞ICR无自制STO小鼠胚胎成纤维细胞SIM (SandosIn bred Mice)无自制更详细信息请查询网页干细胞技术平台附录2培养液配方MEF培养液DMEMGIBCO 12430FBSBIOCHROMS061510%L-gluGIBCO 250302mMNEAA11140100* (0.1mM)mES培养液DMEMGIBCO 12430FBSBIOCHROMS061515%NEAAGIBCO11140-0500.1mML gluGIBCO 250302mM2-mercaptoetha nolGIBCO 219850.1mMLIFCHEMICONESG11071000U/mlmES冻存液DMEMGIBCO 12430干细胞技术平台FBSBIOCHROM S0615DMSO