干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF.docx

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干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF

干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF

【摘要】　　目的：

探讨缺氧诱导因子-1α特异性小片段干扰性RNA对小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的抑制作用。

方法：

构建HIF-1αsiRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α。

选择7d龄C57BL/6J小鼠24只，其中6只为正常组；另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型，并随机分为：

对照组、空载体组和基因治疗组，每组6只。

于出舱前1d，向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒；基因治疗组注射HIF-1αsiRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α。

采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化；SP免疫组织化学检测各组间HIF-1α的表达差异。

结果：

荧光造影视网膜铺片显示，A组整个视网膜血管分布呈均匀网状；B、C组视网膜中周部可见大片无灌注区，见新生血管丛，伴荧光渗漏；D组无灌注区较B，C组明显减少，周边部毛细血管网基本正常，新生血管丛明显减少。

免疫组织化学染色显示，A组HIF-1α蛋白表达阴性；B，C组在神经节细胞层呈阳性表达；D组在神经节细胞层呈弱阳性表达，较B，C组明显减少。

结论：

采用玻璃体腔注射，通过脂质体介导HIF-1αsiRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1α转染视网膜，有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α蛋白质的表达及视网膜新生血管的形成。

【关键词】小干扰RNA　缺氧诱导因子-1α　视网膜新生血管　基因治疗

　　InhibitoryeffectofinterferingRNAtargetingHIF-1αproteininmiceretina

AbstractAIM:

ToinvestigatetheinhibitoryeffectofinterferingRNAtargetingHIF-1αproteinintheretinaof:

HIF-1αsiRNAwasconstructed（pSUPERsiHIF-1α）.Therewere6seven-day-oldC57BL/6Jmiceinthenormalgroup（A）,andanother18miceweredividedrandomlyintocontrolgroup（B）,vectorgroup（C）andgenetherapygroup（D）,with6miceineachgroup,whichwereinducedforretinalneovascularizationbyhypoxia.LiposomewithvectorplasmidandHIF-1αsiRNAwereinjectedintothevitreousinthevectorgroupandgenetherapygrouprespectivelyat1daybeforemiceweremovedouttoroomairfromthecabin.FITC-Dextranangiographywasusedtoobservethepatternoftheretinalvascular.TheexpressionofHIF-1αproteinamongeachgroupwasdetectedusingSP:

Retinalflat-mountsafterFITC-DextranangiographyindicatedthatthevesselsofnormalmiceformedafinedradialbranchingpatterningroupA.Whilethelargevesselsweredistorted,thecapillarywasobstructed,neovascularclustersproliferatedandfluorescenceleakedintheperipheryoftheretinaingroupsBandC.AftertransfectionofHIF-1αsiRNAintotheretina,theretinalneovascularizationandnon-perfusiondistractioningroup）reducedandthestructureofretinaweremoreregularthanthoseingroupsBandC.ImmunohistochemicalstainingshowedthatHIF-1αexpressedmainlyintheretinalganglioncelllayeringroupsBandC,butnotingroupA.AftertransfectionofHIF-1αsiRNAintotheretina,theexpressionofHIF-1αwasdownregulatedcomparedwithgroupsBandC.CONCLUSION:

ThedevelopmentofretinalneovascularizationisinhibitedmarkedlybyintravitrealinjectionofHIF-1αspecificrecombinantplasmidpSUPERsiHIF-1α,whichsuggeststhatitmayhaveapotentialtherapeuticapproachinretinalvasculardisease.

·KEYWORDS:

RNAsmallinterference;hypoxiainduciblefactor-1α;retinalneovascularization;genetherapy

　　0引言

视网膜缺血缺氧导致的视网膜新生血管性疾病如糖尿病性视网膜病变等为一组严重的致盲疾病。

目前,临床上使用光凝术预防和治疗其新生血管的形成，但是,光凝存在许多并发症和副作用，如术后相应视野缩小、光凝过量还可引起出血、脉络膜新生血管形成等。

因而非常有必要从基因和分子水平寻求抑制视网膜新生血管形成的方法。

血管内皮生长因子是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，对血管形成具有重要作用[1]。

同时，VEGF的活性亦受到多种因素的调控。

近年来的研究发现，VEGF在缺氧组织中的转录活化主要受缺氧诱导因子-1α调节，并保持其mRNA的稳定性。

因此，以HIF-1α和VEGF为靶点的基因治疗将为有效抑制视网膜新生血管的形成提供新途径。

我们以RNA干扰为基础，采用脂质体介导的转染方法，研究HIF-1α小片段干扰性RNA对缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1α蛋白质的表达及视网膜新生血管形成的抑制作用。

1材料和方法

材料C57BL/6J小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。

脂质体LipofectamineTM2000和Trizol均购自美国Invitrogen公司。

FITC-Dextran购自美国sigma公司。

山羊抗鼠HIF-1α抗体购自美国SantaCruz公司。

根据人类基因库中人HIF-1α基因的mRNA序列设计siRNA作用靶点，其靶序列为AAGAGGTGGATATGTCTGG。

化学合成64nt的shHIF-1α寡核苷酸序列并退火形成双链模板。

采用Hind和Bgl双酶切空载体质粒，然后与退火形成的双链模板体外连接，经转化、筛选等步骤后抽提HIF-1αsiRNA重组质粒，并命名为pSUPERsiHIF-1α。

并测序鉴定重组质粒中shHIF-1α寡核苷酸插入序列的准确性。

方法采用Smith等的氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型。

将18只出生7d后（P7）的C57BL/6J小鼠及其母鼠置于密闭的氧舱，温度控制在℃，舱内通入100%湿润的医用氧气，用CYS-I型数字测氧仪测量氧舱的氧气体积分数，每6h一次，控制氧气体积分数（750±20）mL/L，5d后（P12）回到正常氧环境，氧气体积分数为（200±10）mL/L，制作缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型，并随机分为对照组、空载体组和基因治疗组，每组6只。

另取6只正常的P19C57BL/6J小鼠作为对照。

在小鼠出舱的前1d，向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒-脂质体复合物共1μL；基因治疗组小鼠注射HIF-1αsiRNA重组质粒-脂质体复合物共1μL。

注射完后立即放回氧舱，1d后小鼠重新出舱。

对照组小鼠不作转染。

视网膜FITC-dextran荧光造影从各组中随机取出19d龄小鼠2只，以100mL/L水合氯醛（5mL/kg）ip麻醉小鼠后,打开胸腔,抽取配置的FITC-Dextran（50mg:

1mL蒸馏水,10000rpm）1mL,用25G1mL注射器灌注左心室后,迅速摘除眼球,置于40g/L多聚甲醛20min。

在便携式显微镜下，沿角巩膜剪开眼球,去除角膜、晶状体，用自制玻璃棒小心娩出视网膜，放射状剪开，置于干净载玻片上，铺平，滴20g/L明胶一滴,盖上盖玻片，置于OlympusBX50荧光显微镜下，采用激发光波长490nm及滤过波长520nm观察并比较视网膜血管形态的变化，同时照相。

视网膜HIF-1α蛋白质的表达采用链亲和素法检测视网膜中HIF-1α的表达。

4组各剩余4只小鼠于出舱后2h，经10g/L戊巴比妥钠30mg/kgip麻醉后摘除眼球，40g/L多聚甲醛固定过夜，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片方向与视轴相平行，连续切片的厚度为6μm，每只眼球随机取出4张切片，常规脱蜡至水，滴加30g/LH2O2于切片上10min，阻断内源性过氧化氢酶，PBS冲洗3min×3次，放入枸橼酸盐缓冲液中95℃修复15min，滴加试剂A室温封闭10min，加一抗4℃过夜，次日PBS冲洗3min×3次，滴加试剂B室温10min,PBS冲洗3min×3次，滴加试剂C室温10min，PBS冲洗3min×3次，DAB显色5min，自来水冲洗，苏木素复染30s，脱水透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察4组小鼠视网膜中HIF-1α的表达差异，在细胞核中发现棕色颗粒判定为阳性表达。

2结果

视网膜FITC-dextran荧光造影A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜走行的弓形血管。

视网膜血管交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状。

B、C组P19小鼠视网膜血管形态和分布发生了明显变化，视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏。

D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常。

视网膜HIF-1α的表达在正常视网膜组织中HIF-1α蛋白表达阴性；在高氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型及空载体注射组视网膜中HIF-1α蛋白质主要表达在神经节细胞层；基因治疗组HIF-1α蛋白在神经节细胞层的表达呈弱阳性，较B、C组明显减少。

3讨论

新生血管形成是个极其复杂的病理生理过程，它涉及血管内皮细胞的活化、增殖、迁移，血管管腔形成等。

一些生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、血栓反应素－1、色素上皮分离因子、bFGF、TGF-β、一氧化氮、基质金属蛋白酶家族等均参与了新生血管的形成。

缺氧诱导因子-1（HIF-1）是机体在低氧环境下启动对低氧产生适应性反应的关键物质，通过与HRE结合,诱导其下游基因VEGF的表达增强，在缺血性视网膜新生血管的形成中发挥着重要的作用。

由l20kDa的α亚基和91/93/94kDa的β亚基组成，其中HIF-lα是主要的功能亚基，HIF-1的活性主要是由HIF-lα的蛋白质水平和活性决定的;而β亚基则属于结构亚基。

在血管的发育过程中,HIF-1对血管新生也起重要作用,它是VEGF的转录活化因子,通过转录活化编码VEGF基因而刺激血管新

图1FITC-Dextran荧光照影视网膜铺片A：

A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状；B，C：

B、C组P19小鼠视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏；D：

D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常

　　图2小鼠视网膜HIF-1α蛋白质的表达差异A：

A组P12小鼠视网膜中HIF-1α蛋白表达阴性；B，C：

B、C组HIF-1α蛋白表达呈阳性，主要表达在神经节细胞层；D：

D组HIF-1α蛋白表达明显减少。

生。

因此,HIF-1也被称为VEGF的管家转录因子。

缺乏HIF-1的表达,VEGFmRNA水平显着降低;即使在缺氧条件下,VEGFmRNA也未被诱导表达。

Ozaki等在缺氧建立的缺血性视网膜病变的小鼠模型研究中发现,视网膜内HIF-1α水平于缺氧2h时达最高峰，缺氧24h时HIF-1α水平回到基线水平，而VEGF于缺氧6h后在内核层表达增强,且持续增高数十天，表明对于缺血性视网膜病变HIF-1α水平的增加与VEGF表达的增强在时间和空间上密切相关，HIF-1α介导的VEGF上调在缺血性视网膜病变的发展中起着重要作用。

Masuda等发现，质粒包裹于脂质体中，转染至视网膜24h开始表达；因此，本试验选择HIF-lα为靶点，在小鼠出氧舱前1d向小鼠玻璃体腔注射HIF-1αsiRNA重组质粒-脂质体复合物，旨在揭示当HIF-lα处于高峰表达时，pSUPERsiHIF-1α对其及视网膜新生血管的抑制作用。

RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。

研究显示，dsRNA通过两种机制抑制细胞蛋白质的合成。

第一种为非特异性途径，大于30bp的双链RNA进入细胞后可以激活干扰素应答系统，从而活化RNA依赖的蛋白激酶，乃至广泛抑制细胞蛋白质合成。

第二种为特异性途径，外源性或内源性dsRNA在细胞内被一种RNA酶Ⅲ-Dicer结合，随即被切割成21～23核苷酸的短链RNA，即小片段干扰RNA[10]。

siRNA与Dicer结合形成RISC复合体（RNAinducedsilencingcomplex），siRNA作为引导序列，识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体与mRNA结合，核酸酶Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段，从而特异性地抑制靶基因的表达。

而新产生的双链RNA可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应，引发“基因沉默”。

基于对siRNA研究的不断深入及其在抑制视网膜血管新生方面的潜在价值，本研究构建了HIF-1α的siRNA质粒，旨在通过基因沉默下调视网膜HIF-1α的表达,进而使其下游基因VEGF表达降低，从而抑制视网膜新生血管。

在本实验中，正常组视网膜未见明显HIF-1α蛋白阳性表达，说明在常氧条件下,HIF-1α由结构中的氧依赖降解结构域（ODD）控制,并通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解[11]。

缺氧2h后，对照组和空载体组视网膜HIF-1α蛋白呈阳性表达，主要表达于节细胞的胞核。

这可能是节细胞层对组织缺氧最敏感,而HIF-1α在缺氧的细胞内积聚,并与HIF-1β形成二聚体,通过HIF-1αC末端的转录激活区域（C-TAD）诱导辅激活蛋白CBP/P300从胞浆进入胞核,共同形成大分子复合物,并与缺氧反应基因的缺氧反应元件（HRE）上的HIF-1结合位点（5′-TACGTG-3′）结合,促进缺氧反应基因的转录,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应[12]。

当pSUPERsiHIF-1α转染视网膜后，HIF-1α蛋白合成明显受抑制,胞核显棕色的细胞数量及程度明显减少，且视网膜新生血管受到明显抑制。

因而证实了HIF-1αsiRNA能有效抑制HIF-1α的表达和视网膜新生血管的形成；另一方面HIF-1αsiRNA在缺氧环境中亦能发挥RNA干扰效应。

我们通过体外重组HIF-1α特异性siRNA，采用玻璃体注射途径，有效地下调了视网膜HIF-1α蛋白质的表达，以及抑制了视网膜新生血管的形成，因而为有效抑制眼内新生血管的形成提供了新的途径。

但是如何选择高效基因表达系统，提高转染效率及安全性，以达到眼内新生血管的彻底根除等相关问题尚待进一步研究。

【参考文献】

1BoydSR,TanD,BunceC,GittosA,NealeMH,HungerfordJL,Charnock-JonesSandCreeIA.Vascularendothelialgrowthfactoriselevatedinocularfluidsofeyesharbouringuvealmelanoma:

identificationofapotentialtherapeuticwindow.BrJOphthalmol,2002;86（4）:

448-452

2MousaSA,LorelliW,Campochiaro　ofhypoxiaandextracellularmatrixintegrinbindinginthemodulationofangiogenicgrowthfactorssecretionbyretinalpigmentedepithelialcells.JCellBiochem,1999;74

（1）:

135-143

3SmithLE,WesolowskiE,McLellanA,KostykSK,D‘AmatoR,SullivanR,D‘AmorePA.Oxygen-inducedretinopathyinthemouse.InvestOphthalmolVisSci,1994;35

（1）:

101-110

4SunX,KanwarJR,LeungE,LehnertK,WangD,Krissansen　enhances　cancerimmunotherapyindependentlyofeffectsonvascularendothelialgrowthfactorexpression.CancerGeneTher,2001;8（10）:

719-727

5SutterCH,LaughnerE,andSemenzaGL.Hypoxia-induciblefactor1alphaproteinexpressioniscontrolledbyoxygen-regulatedubiquitinationthatisdisruptedbydeletionsandmissensemutations.ProcNatlAcadSciUSA，2000;97（9）:

4748-4753

6KeckPJ,HauserSD,KriviG,SanzoK,WarrenT,FederJ,Connolly　permeabilityfactor,anendothelialcellmitogenrelatedtoPDGF.Science,1989;246（4935）:

1309-1312

7VincentKA,ShyuKG,LuoY,MagnerM,TioRA,JiangC,GoldbergMA,AkitaGY,GregoryRJ,Isner　isinducedinarabbitmodelofhindlimbischemiabynakedDNAencodinganHIF-lalpha/VP16hybridtranscriptionfactor.Circulation,2000;102（18）:

2255-2261

8OzakiH,YuAY,DellaN,OzakiK,LunaJD,YamadaH,HackettSF,OkamotoN,ZackDJ,SemenzaGL,CampochiaroPA.Hypoxiainduciblefactor-1alphaisincreasedinischemicretina:

temporalandspatialcorrelationwithVEGFexpression.InvestOphthalmolVisSci,1999;40

（1）:

182-189

9MasudaI,MatsuoT,YasudaT,MatsuoN.Genetransferwithliposomestotheintraoculartissuesbydifferentroutesofadministration.InvestOphthalmolVisSci,1996;37（9）:

1914-1920

10HammondSM,BernsteinE,BeachD,HannonGJ.AnRNA-directednucleasemediatespost-transcriptionalgenesilencinginDrosophilacells.Nature,2000;404（6775）:

293-296

11HuangLE,AranyZ,LivingstonDM,andBunn　ofhypoxia-inducibletranscriptionfactordependsprimarilyuponredox-sensitivestablilizationofitsalphasubunit.JBiolChem,1996;271（50）:

32253-32259

12HuangLE,BunnHF.Hypoxia-induciblefactoranditsbiomedicalrelevance.JBCPapersinPress,2003;278（22）:

19575-19578