干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF.docx

1、干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF干扰RNA抑制小鼠视网膜HIF【摘要】 目的：探讨缺氧诱导因子-1特异性小片段干扰性RNA对小鼠视网膜HIF-1蛋白质的抑制作用。方法：构建HIF-1 siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1。选择7d龄C57BL/6J小鼠24只，其中6只为正常组；另18只建立缺氧诱导的视网膜新生血管模型，并随机分为：对照组、空载体组和基因治疗组，每组6只。于出舱前1d，向空载体组小鼠玻璃体腔注射pSUPER空载体质粒；基因治疗组注射HIF-1 siRNA 重组质粒pSUPERsiHIF-1。采用FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片观察4组小鼠视网膜血管形态变化； SP

2、免疫组织化学检测各组间HIF-1的表达差异。 结果：荧光造影视网膜铺片显示，A组整个视网膜血管分布呈均匀网状；B、C组视网膜中周部可见大片无灌注区，见新生血管丛，伴荧光渗漏；D组无灌注区较B，C组明显减少，周边部毛细血管网基本正常，新生血管丛明显减少。免疫组织化学染色显示，A组HIF-1蛋白表达阴性；B，C组在神经节细胞层呈阳性表达； D组在神经节细胞层呈弱阳性表达，较B，C组明显减少。 结论：采用玻璃体腔注射，通过脂质体介导HIF-1 siRNA重组质粒pSUPERsiHIF-1转染视网膜，有效地抑制了缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-1蛋白质的表达及视网膜新生血管的形成。【关

3、键词】 小干扰RNA缺氧诱导因子-1视网膜新生血管基因治疗Inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1 protein in mice retina Abstract AIM: To investigate the inhibitory effect of interfering RNA targeting HIF-1 protein in the retina of : HIF-1 siRNA was constructed (pSUPERsiHIF-1). There were 6 seven-day-old C57BL/6J m

4、ice in the normal group (A), and another 18 mice were divided randomly into control group (B), vector group (C) and gene therapy group (D), with 6 mice in each group, which were induced for retinal neovascularization by hypoxia. Liposome with vector plasmid and HIF-1 siRNA were injected into the vit

5、reous in the vector group and gene therapy group respectively at 1 day before mice were moved out to room air from the cabin. FITC-Dextran angiography was used to observe the pattern of the retinal vascular. The expression of HIF-1 protein among each group was detected using SP : Retinal flat-mounts

6、 after FITC-Dextran angiography indicated that the vessels of normal mice formed a fined radial branching pattern in group A. While the large vessels were distorted, the capillary was obstructed, neovascular clusters proliferated and fluorescence leaked in the periphery of the retina in groups B and

7、 C. After transfection of HIF-1 siRNA into the retina, the retinal neovascularization and non-perfusion distraction in group ) reduced and the structure of retina were more regular than those in groups B and C. Immunohistochemical staining showed that HIF-1 expressed mainly in the retinal ganglion c

8、ell layer in groups B and C, but not in group A. After transfection of HIF-1 siRNA into the retina, the expression of HIF-1 was downregulated compared with groups B and C. CONCLUSION: The development of retinal neovascularization is inhibited markedly by intravitreal injection of HIF-1 specific reco

9、mbinant plasmid pSUPERsiHIF-1, which suggests that it may have a potential therapeutic approach in retinal vascular disease. KEYWORDS: RNA small interference; hypoxia inducible factor-1; retinal neovascularization; gene therapy 0引言 视网膜缺血缺氧导致的视网膜新生血管性疾病如糖尿病性视网膜病变等为一组严重的致盲疾病。目前,临床上使用光凝术预防和治疗其新生血管的形成，但

10、是,光凝存在许多并发症和副作用，如术后相应视野缩小、光凝过量还可引起出血、脉络膜新生血管形成等。因而非常有必要从基因和分子水平寻求抑制视网膜新生血管形成的方法。血管内皮生长因子是血管内皮细胞的特异性有丝分裂原，对血管形成具有重要作用1。同时，VEGF的活性亦受到多种因素的调控。近年来的研究发现，VEGF在缺氧组织中的转录活化主要受缺氧诱导因子-1调节，并保持其mRNA的稳定性。因此，以HIF-1和VEGF为靶点的基因治疗将为有效抑制视网膜新生血管的形成提供新途径。我们以RNA干扰为基础，采用脂质体介导的转染方法，研究HIF-1小片段干扰性RNA对缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型视网膜中HIF-

11、1蛋白质的表达及视网膜新生血管形成的抑制作用。 1材料和方法 材料 C57BL/6J小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供。脂质体LipofectamineTM 2000和Trizol均购自美国Invitrogen公司。FITC-Dextran 购自美国sigma公司。山羊抗鼠HIF-1抗体购自美国Santa Cruz公司。根据人类基因库中人HIF-1基因的mRNA序列设计siRNA作用靶点，其靶序列为AAGAGGTGGATATGTCTGG 。化学合成64nt的shHIF-1寡核苷酸序列并退火形成双链模板。采用Hind 和Bgl 双酶切空载体质粒，然后与退火形成的双链模板体外连接，经转化、筛选等

12、步骤后抽提HIF-1 siRNA重组质粒，并命名为pSUPERsiHIF-1。并测序鉴定重组质粒中shHIF-1寡核苷酸插入序列的准确性。 方法 采用Smith 等的氧诱导小鼠视网膜新生血管动物模型。将18只出生7d后(P7)的C57BL/6J小鼠及其母鼠置于密闭的氧舱，温度控制在，舱内通入100 %湿润的医用氧气，用CYS-I型数字测氧仪测量氧舱的氧气体积分数，每6h一次，控制氧气体积分数(75020)mL/L，5d后(P12) 回到正常氧环境，氧气体积分数为(20010)mL/L，制作缺氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型，并随机分为对照组、空载体组和基因治疗组，每组6只。另取6只正常的P19

13、C57BL/6J小鼠作为对照。在小鼠出舱的前1d，向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒-脂质体复合物共1L；基因治疗组小鼠注射HIF-1 siRNA重组质粒-脂质体复合物共1L。注射完后立即放回氧舱，1d后小鼠重新出舱。对照组小鼠不作转染。 视网膜 FITC-dextran荧光造影从各组中随机取出19d龄小鼠2只，以100 mL/L水合氯醛(5mL/kg)ip麻醉小鼠后,打开胸腔,抽取配置的FITC-Dextran (50mg:1mL蒸馏水,10 000 rpm)1mL,用25G 1mL注射器灌注左心室后,迅速摘除眼球, 置于40g/L多聚甲醛20min。在便携式显微镜下，沿角巩膜剪开眼球,去

14、除角膜、晶状体，用自制玻璃棒小心娩出视网膜，放射状剪开，置于干净载玻片上，铺平，滴20g/L明胶一滴,盖上盖玻片，置于Olympus BX50荧光显微镜下，采用激发光波长490nm及滤过波长520nm观察并比较视网膜血管形态的变化，同时照相。 视网膜HIF-1蛋白质的表达 采用链亲和素法检测视网膜中HIF-1的表达。4组各剩余4只小鼠于出舱后2h，经10g/L戊巴比妥钠30mg/kg ip麻醉后摘除眼球，40g/L多聚甲醛固定过夜，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，切片方向与视轴相平行，连续切片的厚度为6m，每只眼球随机取出4张切片，常规脱蜡至水，滴加30g/L H2O2于切片上10min，阻断内

15、源性过氧化氢酶，PBS冲洗 3min3次，放入枸橼酸盐缓冲液中95修复15min，滴加试剂A室温封闭10min，加一抗4过夜，次日PBS冲洗3min3次，滴加试剂B室温10min, PBS冲洗3min3次，滴加试剂C室温10min，PBS冲洗3min3次，DAB显色5min，自来水冲洗，苏木素复染30s，脱水透明后中性树胶封片，光学显微镜下观察4组小鼠视网膜中HIF-1的表达差异，在细胞核中发现棕色颗粒判定为阳性表达。 2结果 视网膜FITC-dextran荧光造影A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜

16、走行的弓形血管。视网膜血管交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状。B、C组P19小鼠视网膜血管形态和分布发生了明显变化，视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏。D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常。 视网膜HIF-1的表达 在正常视网膜组织中HIF-1蛋白表达阴性；在高氧诱导的小鼠视网膜新生血管模型及空载体注射组视网膜中HIF-1蛋白质主要表达在神经节细胞层；基因治疗组HIF-1蛋白在神经节细胞层的表达呈弱阳性，较B、C组

17、明显减少。 3讨论 新生血管形成是个极其复杂的病理生理过程，它涉及血管内皮细胞的活化、增殖、迁移，血管管腔形成等。一些生长因子如血管内皮生长因子(VEGF) 、血栓反应素1、色素上皮分离因子、bFGF、TGF-、一氧化氮、基质金属蛋白酶家族等均参与了新生血管的形成。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是机体在低氧环境下启动对低氧产生适应性反应的关键物质，通过与HRE结合,诱导其下游基因VEGF的表达增强，在缺血性视网膜新生血管的形成中发挥着重要的作用。由l20kDa的亚基和91/93/94kDa的亚基组成，其中HIF-l是主要的功能亚基，HIF-1的活性主要是由HIF-l的蛋白质水平和活性决定的;而

18、亚基则属于结构亚基。在血管的发育过程中,HIF-1对血管新生也起重要作用,它是VEGF的转录活化因子,通过转录活化编码VEGF基因而刺激血管新 图 1 FITC-Dextran荧光照影视网膜铺片 A：A组P19小鼠视网膜血管基本成熟,自视盘发出的血管向四周呈放射状均匀分布，交叉成网状，分深浅两层，浅层血管较细，呈分支状；深层血管较粗，呈网状；B，C：B、C组P19小鼠视网膜大血管不规则扩张，走行迂曲，中周部大片无灌注区，可见新生血管丛，伴荧光渗漏；D：D组P19小鼠视网膜血管网状结构基本可见，血管迂曲及不规则扩张较B、C组明显减轻，无灌注区及新生血管丛明显减少，视网膜血管网状结构基本正常 图

19、2 小鼠视网膜HIF-1蛋白质的表达差异 A：A组P12小鼠视网膜中HIF-1蛋白表达阴性；B，C：B、C组HIF-1蛋白表达呈阳性，主要表达在神经节细胞层；D：D组HIF-1蛋白表达明显减少。 生。因此, HIF-1也被称为VEGF的管家转录因子。缺乏 HIF-1的表达, VEGFmRNA水平显着降低;即使在缺氧条件下, VEGFmRNA也未被诱导表达。Ozaki等在缺氧建立的缺血性视网膜病变的小鼠模型研究中发现,视网膜内HIF-1水平于缺氧2h时达最高峰，缺氧24h时HIF-1水平回到基线水平，而VEGF于缺氧6h后在内核层表达增强,且持续增高数十天，表明对于缺血性视网膜病变HIF-1水平

20、的增加与VEGF表达的增强在时间和空间上密切相关，HIF-1介导的VEGF上调在缺血性视网膜病变的发展中起着重要作用。Masuda等发现，质粒包裹于脂质体中，转染至视网膜24h开始表达；因此，本试验选择HIF-l为靶点，在小鼠出氧舱前1d向小鼠玻璃体腔注射HIF-1 siRNA重组质粒-脂质体复合物，旨在揭示当HIF-l处于高峰表达时，pSUPERsiHIF-1对其及视网膜新生血管的抑制作用。 RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。研究显示，dsRNA通过两种机制抑制细胞蛋白质的合成。第一种为非特异性途径，大于30bp的双链RNA进入细胞后可以激活

21、干扰素应答系统，从而活化RNA依赖的蛋白激酶，乃至广泛抑制细胞蛋白质合成。第二种为特异性途径，外源性或内源性dsRNA在细胞内被一种RNA酶-Dicer结合，随即被切割成2123核苷酸的短链RNA，即小片段干扰RNA10。siRNA与Dicer结合形成RISC复合体 (RNA induced silencingcomplex)，siRNA作为引导序列，识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体与mRNA结合，核酸酶Dicer将mRNA切割成2123nt的片段，从而特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的双链RNA可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应，引发“基因沉默

22、”。 基于对siRNA研究的不断深入及其在抑制视网膜血管新生方面的潜在价值，本研究构建了HIF-1的siRNA质粒，旨在通过基因沉默下调视网膜HIF-1的表达,进而使其下游基因VEGF表达降低，从而抑制视网膜新生血管。 在本实验中，正常组视网膜未见明显HIF-1蛋白阳性表达，说明在常氧条件下, HIF-1 由结构中的氧依赖降解结构域(ODD) 控制,并通过泛素- 蛋白酶体途径迅速降解11。缺氧2h后，对照组和空载体组视网膜HIF-1蛋白呈阳性表达，主要表达于节细胞的胞核。这可能是节细胞层对组织缺氧最敏感,而HIF-1在缺氧的细胞内积聚,并与HIF-1形成二聚体,通过HIF-1C 末端的转录激活

23、区域(C-TAD) 诱导辅激活蛋白CBP/ P300 从胞浆进入胞核,共同形成大分子复合物,并与缺氧反应基因的缺氧反应元件( HRE) 上的HIF-1 结合位点(5- TACGTG-3) 结合,促进缺氧反应基因的转录,引起细胞对缺氧的一系列适应性反应12。当pSUPERsiHIF-1转染视网膜后，HIF-1蛋白合成明显受抑制,胞核显棕色的细胞数量及程度明显减少，且视网膜新生血管受到明显抑制。因而证实了HIF-1 siRNA能有效抑制HIF-1的表达和视网膜新生血管的形成；另一方面HIF-1 siRNA在缺氧环境中亦能发挥RNA干扰效应。我们通过体外重组HIF-1特异性siRNA，采用玻璃体注射

24、途径，有效地下调了视网膜HIF-1蛋白质的表达，以及抑制了视网膜新生血管的形成，因而为有效抑制眼内新生血管的形成提供了新的途径。但是如何选择高效基因表达系统，提高转染效率及安全性，以达到眼内新生血管的彻底根除等相关问题尚待进一步研究。 【参考文献】 1 Boyd SR, Tan D, Bunce C, Gittos A, Neale MH, Hungerford JL, Charnock-Jones S and Cree IA. Vascular endothelial growth factor is elevated in ocular fluids of eyes harbouring

25、uveal melanoma:identification of a potential therapeutic window. Br J Ophthalmol ,2002;86(4):448-452 2 Mousa SA, Lorelli W, Campo chiaroof hypoxia and extracellular matrix integrin binding in the modulation of angiogenic growth factors secretion by retinal pigment edepithelial cells. J Cell Biochem

26、,1999;74(1):135-1433 Smith LE, Wesolowski E, McLellan A,Kostyk SK,DAmato R,Sullivan R,DAmore PA. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1994;35(1):101-1104 Sun X,Kanwar JR,Leung E,Lehnert K,Wang D,Krissansenenhancescancer immunotherapy independently of effects on vascula

27、r endothelial growth factor expression. Cancer Gene Ther ,2001;8(10):719-7275 Sutter CH, Laughner E,and Semenza GL. Hypoxia-inducible factor 1alpha protein expression is controlled by oxygen-regulated ubiquitination that is disrupted by deletions and missense mutations. Proc Natl Acad Sci USA ，2000;

28、97(9):4748-47536 Keck PJ, Hauser SD, Krivi G, Sanzo K,Warren T, Feder J,Connollypermeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science ,1989;246 (4935):1309-13127 Vincent KA, Shyu KG, Luo Y, Magner M, Tio RA, Jiang C,Goldberg MA, Akita GY, Gregory RJ, Isneris induced in a rabbit m

29、odel of hindlimb ischemia by naked DNA encoding an HIF-l alpha/VP16 hybrid transcription factor. Circulation ,2000;102(18):2255-22618 Ozaki H, Yu AY, Della N,Ozaki K,Luna JD,Yamada H,Hackett SF,Okamoto N,Zack DJ,Semenza GL,Campochiaro PA. Hypoxia inducible factor-1alpha is increased in ischemic reti

30、na: temporal and spatial correlation with VEGF expression. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1999;40(1):182-1899 Masuda I, Matsuo T, Yasuda T,Matsuo N. Gene transfer with liposomes to the intraocular tissues by different routes of administration. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1996;37(9):1914-192010 Hammond SM

31、 , Bernstein E , Beach D,Hannon GJ . An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells . Nature ,2000;404(6775) :293-29611 Huang LE, Arany Z, Livingston DM, and Bunnof hypoxia- inducible transcription factor depends primarily upon redox-sensitive stablilization of its alpha subunit. J Biol Chem ,1996;271 (50): 32253-3225912 Huang LE, Bunn HF. Hypoxia-inducible factor and its biomedical relevance. JBC Papers in Press ,2003;278(22):19575-19578