仪器分析.docx

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仪器分析

用紫外检测器就可以做梯度洗脱，用差示检测器就不做梯度洗脱。

凡是吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱、排阻色谱都要洗脱，分配色谱不需要洗脱

色谱柱分为：

填充柱、毛细管柱

树脂resin：

人工合成的固相介质。

一般以聚苯乙烯为基质，当经修饰带有磺酸基或羧基时可用做阳离子交换剂；携带伯胺或季胺基时可作阴离子交换剂等。

树脂是制造塑料的主要原料。

按树脂合成反应分类，可将树脂分为加聚物和缩聚物。

加聚物是指由加成聚合反应制得的聚合物，其链节结构的化学式与单体的分子式相同，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯等。

缩聚物是指由缩合聚合反应制得的聚合物，其结构单元的化学式与单体的分子式不同，如酚醛树脂、聚酯树脂、聚酰胺树脂等。

凝胶：

溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体（在干凝胶中也可以是气体—-多孔）这样一种特殊的分散体系称作凝胶。

没有流动性。

内部常含有大量液体。

例如琼脂的含水量都可达99%以上。

可分为弹性凝胶和脆性凝胶。

弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀，例如明胶等。

脆性凝胶失去或重新吸收分散介质时，形状和体积都不改变，例如硅胶等。

大孔树脂：

是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物，大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体,加入乙烯苯为交联剂,甲苯、二甲苯为致孔剂,经聚合反应制备而成。

聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大大小小、形状各异、互相贯通的孔穴。

色谱的分类：

1、吸附色谱有化学吸附（亲和层析属于化学吸附）、物理吸附----硅胶、氧化铝、聚xx酰胺、活性炭、薄层吸附层析（硅胶、氧化铝、聚酰胺）、气相色谱中的气固吸附色谱、HPLC中的液固吸附色谱2、分配色谱：

固定相、流动相都是液体，固定相液体用载体（硅胶、硅藻土、纤维素、滤纸等）吸附固定起来。

利用流动相中各种物质在固定相（液体）和流动相（液体）之间的分配系数不同而分离，在流动相中分配系数大的成分移动速度较快而先出来。

固定相极性大，流动相极性小的是正相色谱，极性强的被保留。

固定相是极性小，流动相极性大的是反相色谱，非极性强的被保留------滤纸层析、纤维素硅藻土含水大于17%的硅胶薄层分配层析、气相色谱中的气液分配色谱、高效液相色谱HPLC中的液液分配色谱（正相、反相）3，离子交换色谱---疏水：

母体是树脂（聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸）；亲水：

母体是纤维素、葡聚糖凝胶、交联琼脂糖凝胶；薄层离子交换层析，HPLC中的离子交换色谱4、排阻色谱/凝胶色谱生物大分子可用排阻色谱分离---葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）、羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚苯乙烯凝胶（商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜，交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂）、薄层凝胶层析，HPLC中的排阻色谱5、亲和色谱特异性吸附专一性强如碱基配对、抗体与抗原。

亲和色谱（AffinityChromatography）以在不同基体上，键合多种不同特征的配体作固定相，用不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核酸、核苷酸、核酸、酶等）与基体上键连的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。

6、大孔树脂吸附色谱法（吸附+分子筛，多种作用）分析色谱/制备色谱：

很多初接触色谱领域的朋友对制备色谱这个名词比较陌生。

其实，在化学化工医药等广泛采用的层析法以及薄层色谱就是最为典型的制备色谱，换句话说，将分析色谱的进样量增大，同时得出大量的所需物质（馏分）的过程就可以称为制备色谱。

分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。

制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。

而制备色谱系统则是利用制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测试设备联用的总称。

制备色谱中的“制备”这一概念指获得足够量的单一化合物，以满足研究和其它用途。

制备色谱的出现，使色谱技术与经济利益建立了联系。

制备量大小和成本高低是制备色谱的两个重要指标。

定性定量方法：

薄层层析用迁移距离定性，用出峰时间定性，标准品绘制标准曲线内标（加入样品中不含有，与待测组分保留时间相近，又能完全分开的纯品物质）、外标（以待测组分的纯品为对照物）、色谱峰面积

一、气相色谱：

待测物和柱子的极性要一致，

柱子怕水，不能含CL。

N2为载气

样品处理：

研磨、均匀、有机溶剂萃取、先酯化后酰化、加无水硫酸钠除水、过滤----衍生化是为了降低其沸点，便于气化。

柱温：

程序升温

定量方法：

标准品绘制标准曲线内标（加入样品中不含有，与待测组分保留时间相近，又能完全分开的纯品物质）、外标（以待测组分的纯品为对照物）、色谱峰面积

学校设备：

HP-5非极性柱、FID安捷伦6820

二、液相色谱：

样品处理：

均匀、加水溶解、乙腈定容、过滤，加热、超声波除去CO2、乙醇，用NaOH调PH至接近中性样品最好澄清、脱色

流动相进柱前要超声波脱气、过滤

柱温：

室温

被吸附后梯度洗脱

学校设备：

C18柱糖基柱/氨基柱差示、紫外检测器PE200

低极性溶解于烃类，中等极性可溶于醇类，

流动相的选择：

高纯度、液-液色谱中流动相和固定相不能互溶一个亲水一个疏水、液固色谱中硅胶吸附剂不能用碱性溶剂（胺类）、氧化铝吸附剂不能用酸性溶剂、若用紫外检测器则流动相不能对紫外光有吸收、保留时间不能太短或太长

根据极性选择流动相：

如正相液-液色谱（流动相极性<固定相极性）中，可先选中等极性的溶剂作为流动相，若组分保留时间太短，表示溶剂极性太大（组分被固定相相似相溶而吸附），可改用极性稍弱的溶剂。

极性：

水>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>醋酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>笨>氯丙烷>甲苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>庚烷>煤油

流动相分为：

底剂、洗脱剂

正相色谱中：

底剂常采用低极性溶剂如正己烷、笨、氯仿洗脱剂常采用极性较强的醚、酯、酮、醇、酸。

反相色谱中：

常用水作为流动相的主体底剂加入不同配比的有机溶剂如甲醇、乙腈、二氧六环、四氢呋喃

定量方法：

标准品

三、离子交换色谱

各种阴离子的滞留次序：

柠檬酸离子>硫酸根离子>草酸离子>碘离子>硝酸根离子>铬酸根离子>溴离子>SCN->氯离子>HCOO->CH3COO->OH->F-柠檬酸离子洗脱要比F-快，各种阳离子的滞留次序：

Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

离子交换色谱主要是在含水杂质中进行的。

组分的保留时间可用流动相中的盐浓度或离子强度、PH来控制，盐浓度增加保留时间降低，流动相PH增加阳离子交换柱保留值降低、阴离子交换柱保留时间增加。

学校设备：

戴安ICS2500ECD电导检测器单柱非抑制型氨基酸直接分析仪

用于能在溶剂中电离的物质离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相

分为单柱非抑制型和双柱抑制型：

分离阳离子HCL洗脱分离柱用阳离子交换柱--抑制柱用高容量OH-型阴离子交换柱将HCL变成电导率很小的水以消除本底电导对电导检测器的影响

分离阴离子NaOH洗脱分离柱用阴离子交换柱--抑制柱用高容量H+型阳离子交换柱将NaOH变成水强盐Nacl等强电解质会干扰电导检测器，要加抑制柱。

以消除本底电导的影响。

如果阴离子分离采用电导率低的洗脱液（流动相）如低浓度的苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐作洗脱剂阳离子分离采用稀硝酸、乙二胺硝酸盐稀溶液作洗脱剂背景电导较低可用单柱型非抑制型

样品处理：

样品最好澄清脱色、不能有疏水性大分子、蛋白质、脂肪、肽、加水、过滤、NaOH流动相用超声波脱气。

蛋白质可先用酸水解，

学校的单柱非抑制型流动相中不能含有强电解质背景离子否则会干扰电导检测器

柱温：

室温

定量：

标准品

四、排阻色谱法：

大分子不能进入凝胶柱的孔内最先出来，小分子最后出来

排阻色谱法用的溶剂必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶并防止产生吸附作用，粘度不要太高分离高分子有机化合物常用的是：

四氢呋喃、甲苯、间甲苯、N，N-二甲基甲酰胺

生物物质的分离常用：

水、缓冲盐溶液、乙醇、丙酮

五、原子吸收：

如果要测定镁离子的含量，先将试样喷成雾状进入燃烧的火焰中，含镁盐的雾滴在火焰温度下，挥发并离解成鎂原子蒸汽。

再用镁空心阴极灯作光源，它辐射出的镁特征谱线的光通过一定厚度的镁原子蒸气时，部分被蒸汽中的基态鎂原子吸收而减弱，我们根据减弱的程度，来测定试样中镁的含量。

学校设备：

北京普西火焰石墨炉灯很多

样品处理：

消化消化的目的：

除去有机物防止干扰、把一些络合态、不溶物中的元素释放出来、使试样的介质和标准溶液保持一致、将原子态转化成离子态、

定量：

标准品标准曲线法标准加入法

六、薄层层析TLC（可先薄层层析看看有什么物质再去柱层析；可通过薄层层析测定迁移率来测定比移率从而判断你所选用的流动相溶剂能否有效分离，展开剂是否恰当；洗脱剂：

先用薄层层析确定其种类和浓度。

硅胶、聚酰胺调浆--涂板--干燥--活化--点样展开剂层析）

点样—层析—显色（如果样品本身有色可直接看见斑点所在的位置，如果本身无色，就需要用显色剂或紫外光显色，此外如果薄层是由无机物制成的还可以用强腐蚀性的浓硫酸、硝酸、铬酸使有机物碳化显出黑色的斑点）--定性定量（与已知标准物质的迁移率Rf值对照来定性，定量时先连同支持剂一起刮下，再用溶剂溶解，再测定含量，比较斑点的颜色深度、面积大小，有条件的可用薄层扫描仪来定量分析）又分为：

薄层吸附、分配、离子交换、排阻层析。

上住前的准备工作：

判断黄酮是正电还是负电，决定预处理时先用酸洗还是先用碱洗。

最大处理浓度—击穿浓度，

纸色谱：

滤纸纤维结合水为固定相、有机溶剂为流动相，展开时物质在这两相中不断地进行分配，迁移值Rf，选择展开溶剂时要使被分离物质的Rf值在0.05—0.85之间。

操作：

样品处理（除杂、调PH、浓度）--点样—密闭平衡—展开（上行法、下行法、环行法、）--显色（加与样品反应生成有色物质的显色剂、紫外光）--定性（与已知纯品的Rf值对照）--定量（剪洗、用特制的分光光度计直接比色、斑点面积法）

分配色谱：

固定相、流动相都是液体，固定相液体用载体（硅胶、硅藻土、纤维素、滤纸等）吸附固定起来。

利用流动相中各种物质在固定相（液体）和流动相（液体）之间的分配系数不同而分离，在流动相中分配系数大的成分移动速度较快而先出来。

固定相极性大，流动相极性小的是正相色谱，极性强的被保留。

固定相是极性小，流动相极性大的是反相色谱，非极性强的被保留------滤纸层析、纤维素硅藻土薄层分配层析、气相色谱中的气液分配色谱、高效液相色谱HPLC中的液液分配色谱（正相、反相）

七、凝胶柱、大孔树脂、硅胶柱、离子交换树脂

1、离子交换树脂（Dowex）：

液相中的离子和固相中的离子发生可逆性交换。

样品中带正电荷的叫碱性成分，带负电荷的叫酸性成分。

分为强酸性（H型）阳离子交换树脂--SO3H，电离出SO32-和H+，H+去和阳离子交换，吸附上碱性成分；弱酸性阳离子交换树脂--COOH电离出—COO-和H+；强碱性（OH型）阴离子交换树脂—N+（CH3）3OH，电离出OH-去和阴离子交换，吸附上酸性成分；弱碱性阴离子交换树脂—NH电离出OH－。

先预处理使树脂活化，配制浓度梯度来确定能完全分离的最大承载浓度（击穿浓度）。

交换作用时阳离子和阳离子交换，阴离子和阴离子交换，原来的阳离子、阴离子被取代下去。

适用于酸性、碱性或两性成分的分离，适用于水溶性的小分子如氨基酸、多肽、生物碱、有机酸、酚类，不适用于亲水性生物大分子如蛋白质、酶。

有机碱，通常分子中含有氨基酸官能团-NR2H+有机酸，往往分子中含有-COO−（羧酸）官能团，生物分子可以被离子化：

氨基酸，多肽、核苷、糖类等…

吸附完成后可用改变流动相PH和提高流动相中盐浓度的方法去洗脱树脂上被吸附的目标离子，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一洗脱。

用更强的酸、碱去洗脱。

强酸制弱酸的道理。

被吸附的物质随后为带同类型电荷的其他离子所置换而被洗脱。

由于各种离子或离子化合物对交换剂的结合力不同，因而洗脱的速率有快有慢，形成了层析层。

物质在树脂上结合的牢固程度有差异，选用适当的洗脱液可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

解吸附阶段：

梯度缓冲溶液先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。

经过离子交换被吸附在离子交换剂上的待分离物质，有二种洗脱办法：

一是增加离子强度，使洗脱液中的离子能争夺交换剂的吸附部位，从而将分离的物质置换下来；二是改变pH，使样品离子的解离度降低，电荷减少，因而对交换剂的亲和力减弱而被洗脱下来。

操作：

预处理、再生、转型—缓冲液的选择（离子交换剂不仅可以和被分离物质交换，而且可以和缓冲液中的离子交换，因此缓冲液的PH和离子强度直接影响，被分离物质的交换量。

起始缓冲液的PH和离子强度要能使有效成分与离子交换剂结合，杂质与离子交换剂不结合，或者使有效成分与离子交换剂结合不牢固，杂质与离子交换剂结合牢固。

选择时：

PH通常比有效成分的PI高一个单位（用阴离子交换剂）或低一个单位（用阳离子交换剂），离子强度为0.1）--选用的洗脱液其PH和离子强度要能使有效成分能冲离子交换剂上解离下来一般离子强度要比起始缓冲液高，PH要按离子交换剂的性质来选择。

--被分离物质的洗脱与收集（梯度溶液洗脱，一种是增加离子强度如Nacl、KCl,一般不用弱酸或弱碱的盐；另一种是改变PH，用两种不同PH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的，如果使用的是阳离子交换剂，PH应从低低到高；阴离子交换剂，PH则应从高到低，实际许可的PH范围由待测物质性质的稳定性和离子交换剂的PH限制来决定，梯度的形成可以借助梯度混合器）--绘制洗脱曲线。

从洗脱液的成份而言，洗脱方式有三种：

一是选用单一洗脱液。

此为恒液洗脱法，适用于组分不大复杂的样品；二是选用几种洗脱能力逐步增强的洗脱液相继洗脱，此为阶段洗脱法，适用于各组分对交换剂亲和力比较悬殊的样品；三是用离子强度和pH呈连续梯度变动的洗脱液进行洗脱，使洗脱能力持续增强，此为梯度洗脱法，适用于各组分与交换剂亲和力相近的样品。

　在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，溶液的梯度是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。

被吸附的物质，洗脱时容易交换的先流出来，根据先后顺序就能得到较纯的物质。

经洗脱流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的体积一般以柱体积的1％～2％为宜。

若降低分部收集体积，可提高分辨率。

分部收集洗脱液经相关的检测分析，便可得知所含物质的数量。

也可以用紫外监测仪显示收集的洗脱液在特定波长的吸光度（A）代表被分离物质的浓度，以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。

不仅可以分离阴阳离子，还可根据交换的牢固性、交换剂对不同离子的亲和力（静电引力）不同而分离不同种类的阳离子、阴离子。

离子交换法亦可用于相同电荷离子的分离，其分离的依据是解离程度的不同（酸性或碱性不同的化合物，在相同条件下，其解离程度会有差异）。

解离程度越大，被洗脱下来的速度越慢。

基质：

疏水性离子交换剂--树脂为基质（用苯乙烯和二乙烯苯人工合成）主要用于分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸、AA，其次是用于从蛋白质溶液中除去表面活性剂、清洁剂、尿素、两性电解质。

亲水性离子交换剂，载体孔径大，适合于分离生物大分子---纤维素、葡聚糖、琼脂糖为基质。

离子交换树脂的吸附选择性

　　离子交换树脂对溶液中的不同离子有不同的亲和力，对它们的吸附有选择性。

各种离子受树脂交换吸附作用的强弱程度有一般的规律，但不同的树脂可能略有差异。

主要规律如下：

　　（１）对阳离子的吸附

　　高价离子通常被优先吸附，而低价离子的吸附较弱。

在同价的同类离子中，直径较大的离子的被吸附较强。

一些阳离子被吸附的顺序如下：

　　Fe3+>Al3+>Pb2+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>H+

　　（２）对阴离子的吸附

　　强碱性阴离子树脂对无机酸根的吸附的一般顺序为：

　　SO42－>NO3－>Cl－>HCO3－>OH－

　　弱碱性阴离子树脂对阴离子的吸附的一般顺序如下：

　　OH－>柠檬酸根3－>SO42－>酒石酸根2－>草酸根2－>PO43－>NO2－>Cl－>醋酸根－>HCO3－

　　（３）对有色物的吸附

　　糖液脱色常使用强碱性阴离子树脂，它对拟黑色素（还原糖与氨基酸反应产物）和还原糖的碱性分解产物的吸附较强，而对焦糖色素的吸附较弱。

这被认为是由于前两者通常带负电，而焦糖的电荷很弱。

　　通常，交联度高的树脂对离子的选择性较强，大孔结构树脂的选择性小于凝胶型树脂。

这种选择性在稀溶液中较大，在浓溶液中较小。

2、吸附色谱：

载体（吸附剂）有硅胶（SiO2+H2O）、AL2O3，聚酰胺（polyamide）、活性碳、

根据物质的吸附差别进行分离，物理吸附：

静电、范德华引力，化学吸附：

发生化学反应，半化学吸附：

氢键。

T升高有利于吸附也有利于解吸。

吸附容易，解吸就难。

尽量用物理吸附，好洗脱些。

（在吸附-解吸-吸附的重复中往下流就分开了--及时用薄层层析法定性检查以指导更换洗脱溶剂及合并洗脱液。

）

1）硅胶吸附色谱

硅胶为极性吸附剂，吸附力的大小取决于被分离物质的极性（极性越大，吸附力越强）和洗脱溶剂的极性（溶剂极性越弱，硅胶对被分离物质的吸附能力越强）。

因此，用硅胶吸附色谱分离一组极性不同的混合物时，极性大的物质因吸附力大而洗脱慢；洗脱溶剂的极性增大，洗脱能力增强，洗脱速度加快。

另外硅胶有一定的酸性，在用其分离碱性成分时，需注意。

2）氧化铝吸附色谱

氧化铝亦为极性吸附剂，其吸附规律与硅胶相似。

不同的是，氧化铝有一定的碱性，且具有铝离子，在用其分离一些酸性或酚性成分时，易产生不可逆吸附而不能被溶剂洗脱。

如蒽醌类、黄酮类（葛根异黄酮除外）成分分离时一般不选择氧化铝。

3）活性炭吸附色谱

活性炭为非极性吸附剂，其吸附规律与硅胶、氧化铝恰好相反。

对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对物质表现出强的吸附能力。

常用于水溶液的脱色素，也可用于糖、环烯醚萜苷的分离纯化等。

4）聚酰胺（尼龙）吸附色谱

聚酰胺吸附属于氢键吸附，系通过其分子中众多的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。

因此，聚酰胺吸附色谱特别适合分离酚类、醌类和黄酮类化合物。

聚酰胺对被分离物质吸附力的大小取决于被分离物质分子结构中可与聚酰胺形成氢键缔合的基团数目及氢键作用强度。

同时，溶剂也会影响聚酰胺对被分离物质的吸附，表现出各种溶剂在聚酰胺吸附色谱中洗脱能力有大有小，其由弱到强的大致顺序为水、甲醇、丙酮、氢氧化钠水溶液等。

聚酰胺薄膜层析：

只适用于极性分子的分离（如酚、醌、硝基化合物、AA及其衍生物、核酸），洗脱剂最好选用碱性溶液。

洗脱时洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键，而使被吸附物解吸。

根据吸附的牢固程度，用不同的洗脱剂去梯度洗脱。

一般先用蒸馏水洗脱,再用浓度逐渐增高的乙醇、甲醇洗脱。

多糖、蛋白质、鞣质等水溶性杂质会随着水流下,极性小的物质后下。

对于有些具有酸碱性的物质还可以用不同浓度的酸、碱液结合有机溶剂进行洗脱。

黄酮弱极性的用20%--30%的乙醇+水洗脱，皂苷用40%-50%-90%的乙醇+水洗脱。

碱性物质在碱液中吸附，在酸液中解吸，酸性物质在酸液中吸附，在碱液中解吸。

黄酮因为有酚羟基电离而成酸性所以用酸吸附，碱解吸。

例如麻黄碱,在PH为11.0时吸附最好,为5.0、7.0时由于麻黄碱已质子化吸附量极少。

为了便于解吸，分离极性较强的组分（蛋白质、核酸）时，宜选用极性低的吸附剂，以极性强的展开剂（盐的缓冲液）展开；分离极性较弱的组分（甾体、色素）时，宜选用极性高的吸附剂，以极性较弱的展开剂（有机溶剂）展开。

总之，通过选择吸附剂和展开剂，调整待分离组分的Rf值（比移率，样品中某成分在纸层析或薄层层析特定溶剂系统中移动的距离与流动相前沿的距离之比）在0.3—0.6。

3、大孔树脂吸附色谱法：

（电荷性质正负相吸、位阻、分子筛、极性相似相溶多种效应，兼备吸附和分子筛原理为一体，所以严格来讲大孔树脂吸附色谱和吸附色谱是不同的）被分离物质按其分子体积大小及吸附力的强弱不同而分离。

大孔树脂的选择：

选择与目标物极性相近的大孔树脂分离是把要分离的物质吸附起来，再洗脱它。

（在吸附-解吸-吸附的重复中往下流就分开了--及时用薄层层析法定性检查以指导更换洗脱溶剂及合并洗脱液。

）

4、凝胶：

既有分子筛作用，又有吸附作用？

---理论上将凝胶是分子筛作用，一般情况下凝胶对组分没有吸附作用，但当分离小分子时，溶剂—溶质—固定相之间的相互作用变得重要。

极性不相似的先出来；大分子不穿入，直接流下来，所以先出来，小分子，七弯八拐，所以后出来。

生物大分子可用排阻色谱分离。

凝胶柱分离效率太低了，大孔树脂才能工业化生产，但大孔树脂的选择性没有凝胶柱强。

电泳也不能用于大规模的生产。

类型：

葡聚糖凝胶（Sephadex）只适于在水中应用、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）适用于水溶性生物碱的分离、羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）既可在水中应用，又可在有机溶剂中应用/琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚苯乙烯凝胶（商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜，交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂）。

凝胶柱平衡和洗脱一般用同一种溶液，洗脱液无特殊要求，一般选择使样品稳定的缓冲液，洗脱液的流速要稳定。

5、凝胶电泳：

琼脂，琼脂糖，硅胶，淀粉胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

比色法：

紫外可见分光光度计：

红外：

我们学院没有，化院有。

6、萃取/反萃取：

在溶剂萃取分离过程中，当完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，往往需要将目标产物转移到水相。

这种调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作称为反萃取。

从水中用有机溶剂萃取出来的东西，一定能反萃取回水中。

（调PH、盐浓度）

反胶束萃取：

有机溶剂提取蛋白质时要低温才不变性，实际生产中难做到。

利用电荷性质和直径大小分离的一种方法最常用于蛋白质的分离，盐析沉淀蛋白质可能所有的蛋白质都一起沉淀了，用反胶束萃取可以有目的的提取蛋白质，且不论反胶束团的大小，最起码能把带正电和带负电的区分。

利用表面活性剂制作反胶束团，包裹水中的蛋白质，搅拌，把水中的蛋白质转移到油相中。

萃取时即使100%醇溶的物质，用100%的乙醇提取效果也不好，因为有些杂质不易分离。

弱电解质（多数抗生素、生物碱、AA、皂苷、有机弱碱）的提取不要用丙酮，AA/多肽/蛋白质、有机酸、极性强的抗生素在有机相中分配系数很小，不能用物理萃取，而用化学萃取。

0、根据物质的：

溶解性、分子量（膜、凝胶）、沸点、极性大小、带电、吸附性、分配系数、官能团、稳定性等去分离----方法：

结晶、离心、过滤、蒸馏、液液萃取、液固浸提、膜分离、柱分离、色谱分离、电泳、沉淀法（特别是蛋白质）、调PH（不同蛋白质的PI不同）-----原理：

相似相溶（极性和结构两方面）、同离子效应、强酸制弱酸、蛋白质/胶体（水化层、电荷层）、