实体肿瘤的微环境蛋白质组研究.docx

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实体肿瘤的微环境蛋白质组研究

项目名称：

实体肿瘤的微环境蛋白质组研究

首席科学家：

徐宁志中国医学科学院肿瘤研究所

起止年限：

2011.1至2015.8

依托部门：

卫生部

二、预期目标

1．总体目标

本项目研究的总体目标是，系统分析结肠癌的体外和体内模型中肿瘤微环境的分泌蛋白质组，揭示分泌蛋白质对巨噬细胞、成纤维细胞和结肠上皮细胞的基因表达和功能影响，深入探讨肿瘤微环境中分泌蛋白质在肿瘤发生和发展过程的作用机制。

本项目将通过多种细胞共培养体系和蛋白质组分析获取结肠癌微环境中四种主要细胞相互作用所产生的分泌蛋白质组；将采用标记或非标记的蛋白质组方法，准确测定不同的细胞类型对于细胞共培养系统的总分泌蛋白质的定量贡献；将运用微环境的分泌蛋白质信息，研究它们在结肠上皮细胞癌变、巨噬细胞和成纤维细胞功能异化过程中的分子作用机制；将有效整合小鼠动物模型与细胞模型的分泌蛋白质组数据，发展检测肿瘤相关的生物标记物的测定方法。

通过本项目的执行，我们将全面系统地加深对于实体肿瘤微环境的分泌蛋白质组的了解，革命性地改变传统分泌蛋白质组的研究方法，具体回答肿瘤微环境与肿瘤发生和发展相关的生物学问题。

2．五年目标

1）针对肿瘤微环境研究，发展一整套多种细胞共培养的分泌蛋白质的定量分析方法；

2）同一生物材料的背景下，系统研究肿瘤微环境相关细胞的蛋白质组和生物学行为；

3）发现可应用于临床的结肠癌相关蛋白质标志物和药物靶标；

4）在国际主流杂志发表论文30篇左右，申请发明专利5-10项；

5）造就一支具有综合素质队伍，培养横跨肿瘤基础医学、细胞生物学和蛋白质组学领域的多方位科学人才。

培养一批博士研究生10-15人，硕士研究生20-25人，博士后研究人员5-10人。

三、研究方案

1.学术思路

实体肿瘤微环境是一个相当复杂的开放系统，如何合理简化肿瘤微环境的相关因素是这个领域研究工作所必须考虑的关键问题。

功能明确和细胞数量较多的肿瘤相关细胞是研究肿瘤微环境较为理想的候选细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞等。

肿瘤微环境中各种细胞的主要通讯分子之一是存在于细胞间液的分泌蛋白质，它是微环境中各种细胞所分泌蛋白质的综合产物。

系统地分析肿瘤组织中的分泌蛋白质组，定量地估算肿瘤相关细胞和肿瘤细胞对总分泌蛋白质组的贡献，是肿瘤微环境研究工作中最为基本的要求。

应当选择科学问题明确和前期实验数据翔实的实体肿瘤作为本项目的研究对象，而结肠癌正是这样一个典型实例。

就具体研究材料而言，保持体外和体内实验的生物材料一致性将极大地减少非实验性来源的误差。

C57小鼠背景的细胞和结肠癌模型是具有可操作性的选择。

就蛋白质分析策略而言，整合现代蛋白质分析技术可保证肿瘤微环境分泌蛋白质研究的系统性和严谨性，如亲和层析方法富集低丰度分泌蛋白质、高精度质谱仪提高蛋白质鉴定的准确性和灵敏度、体内或体外标记定量蛋白质组技术分析差异分泌蛋白质、MRM技术测定潜在的蛋白质标志物。

2.技术途径

为了避免实验的误差和技术路线的偏好，本项目将在各课题组实行较为统一的技术途径，如图1所示：

图1.技术路线示意图

在这些技术环节中，我们特别强调下列的技术特点：

1）高精度质谱仪应用于分泌蛋白质组分析：

已建立高通量和高精度的质谱分析平台，拥有VelosOrbitrap和MaXis质谱仪。

这些质谱仪在质谱信号的分辨率和MS/MS扫描速度上已达到当前的最高水平，完全满足分泌蛋白质的肽段分析。

2）单克隆抗体或重组蛋白质在亲和层析中的应用：

在分泌蛋白质或蛋白质生物标志物的研究中，亲和富集技术是至关重要的。

本课题相关团队已建立高通量的蛋白质重组表达和单克隆抗体制备系统，可以实现亲和材料的研发和制备。

3）定量蛋白质分析技术：

广泛采用蛋白质组的定量技术，在标记定量法中主要采用iTRAQ法，而在非标记定量中主要采取MRM法。

同时开展蛋白质组定量分析的统计方法和计算机软件的开发。

4）小鼠细胞系和结肠癌动物模型：

采用两种C57小鼠背景的结肠癌模型—AOM-DSS和APCmin，同时所用的小鼠细胞系同样来自于C57小鼠的遗传背景。

本项目研究已具备了较好的技术平台支撑，承担单位拥有2个国家重点实验室，3个部级重点实验室，项目所需的绝大部分实验仪器和实验手段均已具备，各承担单位间有着长期的良好合作关系和基础。

本项目的研究队伍具有丰富的前期工作积累与相关研究成果及多学科背景，已经建立起成熟的研究手段和方法，有能力完成所计划的研究任务。

3.创新性和特色

本项目的创新之处集中表现在下面五个方面：

1）首次提出了简化肿瘤微环境的实验方案，试图从四种微环境相关的细胞着手，重点考察它们相互作用所产生的分泌蛋白质对肿瘤发生和发展的影响；2）与传统的分泌蛋白质研究所不同的是本项目特别强调多种细胞共培养才是研究肿瘤微环境分泌蛋白质的可行实验方案，二元或三元细胞培养体系及其蛋白质组分析构成了体外细胞实验的主体；3）重视定量蛋白质组分析在二元/三元培养系统中的应用，不仅仅要了解共培养体系的分泌蛋白质谱，还要定量测定不同细胞在总分泌蛋白质谱图中的贡献；4）首次在同一遗传背景的小鼠模型和细胞模型上开展系统的肿瘤微环境研究，其中体外细胞培养探索肿瘤相关分泌蛋白质，而体内动物模型验证和发现肿瘤相关蛋白质；5）参与本课题的团队来自我国肿瘤学界和蛋白质组学界的优秀实验室，在肿瘤微环境、分泌蛋白质、动物模型和蛋白质组研究方面都具备相当的实力。

从地域分布而言，参加的研究团队来自于我国的东西南北中，本项目在真正意义上实践了集中全国精英，团结攻关的理想。

4.取得重大突破的可行性分析

本项目瞄准了当前肿瘤研究的热点和重点，即肿瘤微环境的分子研究。

在项目的执行过程中，我们将建立一套完全新型的肿瘤微环境研究系统，试图从同一遗传背景的小鼠模型中找到体外和体内所共享的肿瘤相关分泌蛋白质，籍此开展它们对巨噬细胞和成纤维细胞异变分子机制的探讨，开展它们对上皮细胞癌变的诱导机制研究。

我们有信心在肿瘤微环境分泌蛋白质领域开辟一条新的道路，在结肠癌相关的蛋白质生物标记物鉴定和测定，结肠癌发生和发展的分子机制研究等方面取得突破。

我们的信心植根于：

1）本项目所提的生物学问题和技术困难在国际间仍然悬而未决，我们和其他的竞争者正处在同一起跑线上；2）参与本项目的各个团队在相关的领域处在先进水平，某些课题已取得了进展；3）参与本项目的实验室已具备开展此项研究的所有的实验条件，特别是已搭建蛋白质组分析平台和已拥有小鼠模型和相关细胞。

同时，项目首席科学家和课题组长在科研项目的组织和协调方面具有丰富的经验，均承担并完成多项国内或国外的重要科研项目。

本项目计划是基于研究团队的研究基础和前期工作而提出的，在本项目的申报过程中，项目专家组及研究骨干多次研讨，围绕本研究计划拟解决的重大科技问题，制定了合理可行的研究方案和技术路线。

相信通过学科交叉、集成多种研究方法，我们研究团队完全有可能在本领域取得突破性进展。

5.课题设置

课题设置思路

本项目首次提出体外的实体肿瘤微环境研究，采用简化细胞组分的策略，选择实体肿瘤中几种生物学行为较为清晰而且相对细胞数量较大的细胞为研究对象，系统考察这些细胞相互作用所产生的分泌蛋白质变化以及它们对于实体肿瘤发生和发展的作用。

在这一基础上开展小鼠肿瘤模型的体内研究，检验体外实验结果与体内实际发生事件的关联性。

根据这样的思路，我们将实体肿瘤的研究对象定位在结肠癌；选择三种微环境相关的细胞来考察肿瘤与其它细胞相互作用所产生的分泌蛋白质；采用两种C57小鼠的结肠癌模型来检验可能的肿瘤蛋白质标志物。

本项目将设置四个课题，分别为，1）结肠癌及其相关巨噬细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关性研究；2）结肠癌及其相关成纤维细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关性研究；3）肿瘤微环境分泌蛋白质介导的上皮细胞癌变的机制研究；4）肿瘤微环境分泌蛋白质与动物模型和临床样本的关联分析。

我们关于课题的设置是从三个层次上给以考虑的：

首先，从简化肿瘤微环境细胞组分着手，我们选择了三个肿瘤相关的微环境细胞，即巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞。

因为我们的基本假设是肿瘤相关分泌蛋白质的研究需要建立在细胞之间的相互作用基础上，这样在简化的微环境体系中就形成了结肠癌细胞与这三种环境细胞的配对，构成了三个二元培养体系和一个三元培养体系（结肠癌细胞/TAM/TAF）。

其次，从体外和体内实验着手，虽然我们在本项目中特别强调细胞系的选择必须考虑到来源的遗传统一性，以减少非实验因素的干扰，但是体外的细胞实验结果最终还需在体内模型得以证实。

因此，我们设定三个课题开展细胞的实验，从二元或三元系统中分析肿瘤相关分泌蛋白质，而设定一个课题从事于小鼠结肠癌模型的分泌蛋白质分析，试图做到体外和体内的实验数据互相呼应。

再次，从生物学问题着手，一般认为上皮细胞受肿瘤微环境影响可能表现于正常上皮细胞的癌变，而巨噬细胞和成纤维细胞则在微环境作用下可能异化变成TAM和TAF，TAM和TAF可显著地促进肿瘤组织的侵润和转移。

因此，在设定课题的生物学问题时，我们有关肿瘤微环境对上皮细胞影响的研究更多地投射在肿瘤的发生机制上；有关肿瘤微环境对巨噬细胞和成纤维细胞影响的研究更多关注于肿瘤的发展机制。

在第四课题中，我们则从动物模型中动态地观察微环境对于肿瘤发生和发展的影响。

课题的关联

本项目的四个课题中，三个课题注重在细胞水平上的分泌蛋白质研究，一个课题聚焦于动物体内肿瘤组织的分泌蛋白质和血液中肿瘤相关蛋白质。

各个课题之间既存在学术逻辑上的必然联系，又有研究内容上的互为补充。

在结肠癌与TAM和/或TAF的分泌蛋白质分析中所得到的结果将应用于上皮细胞癌变的研究中。

同样，正常上皮细胞与结肠癌细胞的差异分泌蛋白质又有助于TAM和TAF的功能分析。

在细胞水平上的分析结果将体现在第四课题上的结肠癌模型中，而动物模型课题组产生的肿瘤组织又服务于细胞课题组的TAM和TAF的制备。

如图2所示，四个课题之间形成了较为完整的研究关联网络，在不同的层次和角度上共同研究结肠癌微环境分泌蛋白质在肿瘤发生和发展过程中的分子机制。

图2.各课题关联示意图

红色代表课题1，绿色代表课题2，黄色代表课题3，蓝色代表课题4。

课题1.结肠癌及其相关巨噬细胞的分泌蛋白质组与肿瘤发展的相关性研究

课题背景

巨噬细胞是肿瘤微环境的一个主要的组成部分。

AlbertoMantovani在1978年首次在实体瘤中观察到先天性免疫细胞聚集的现象。

近年来研究表明，各种免疫细胞向肿瘤（如乳腺癌、胃癌、肝癌、结肠癌、淋巴癌、黑色素瘤）的迁移聚集，其数量和细胞种类与癌症病人的预后和生存率呈现非常密切的联系。

其中，肿瘤相关巨噬细胞TAMs作为肿瘤中重要的免疫细胞组分被广泛研究。

巨噬细胞来源于血液单核细胞，血液单核细胞受肿瘤细胞分泌的如M-CSF，CCL家族蛋白，CXCL家族蛋白等细胞因子或者趋化因子的吸引，被募集至肿瘤病灶，渗入肿瘤内部并进一步转化为TAMs。

正常的巨噬细胞具有吞噬肿瘤细胞，向T细胞呈递抗原，表达细胞因子以活化T细胞及NK细胞的能力。

与此相反，在肿瘤微环境的若干刺激因子的作用下，巨噬细胞转向TAMs，使其失去了正常功能，反而成为肿瘤病人预后差的标志。

大量研究已经表明，TAMs的广泛浸润与乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、膀胱癌等肿瘤的不良预后相关。

肿瘤细胞分泌的蛋白质，例如CSF-1、CCL2,3,4,5,6、MCP1,2,3,4,5、MIP、MIF和VEGF等，可以促进TAMs的聚集，因此，在肿瘤细胞或组织中，这些蛋白质的表达水平与TAMs的数量正相关。

TAM所分泌的蛋白质与肿瘤的发生发展有很大的关系。

首先，TAM可表达多种刺激肿瘤细胞增殖和存活的细胞因子：

EGF、PDGF、TGF-β1、HGF、bFGF、IL-6、IL-1和TNFα等。

TAM是EGF刺激肿瘤增殖的重要细胞来源。

其次，TAM可存在于基底膜部分，且伴有局部CathB和MMP的蛋白水解酶活性增强，促进了肿瘤细胞向周围正常组织的侵袭。

再次，肿瘤生长需要新生血管的形成，这个过程涉及广泛的细胞因子的协同调控，包括bFGF、VEGF、IL-1、IL-8、TNFα、MMP9、MMP2及NO等。

这些分子的协调作用促进内皮细胞的增殖、基质重构及血管形成。

TAM可释放上述促血管生成的分子，同时表达了一系列参与调节血管发生的酶类，包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP12和环氧化酶2，在促进肿瘤组织血管生成过程中发挥重要的作用。

最后，TAM还能释放免疫刺激因子从而使肿瘤细胞逃避免疫系统。

例如，正常的巨噬细胞表达IL-12，它的功能是促进T细胞核NK细胞的增殖，但是在肿瘤细胞分泌IL-10、TGFβ和PGE2的刺激下，TAM失去了表达该因子的能力；相反，将肿瘤细胞和过表达IL-12的TAM共同种植于小鼠时，TAM向T细胞呈递抗原的能力增加，且机体抗肿瘤的能力加强。

在多数肿瘤组织中，肿瘤细胞和巨噬细胞存在一种共生的关系：

巨噬细胞在肿瘤细胞及其释放的可溶性分子的趋化下，迁移至肿瘤局部；TAM产生大量的细胞因子则促进肿瘤的生长、增殖、转移及血管形成并抑制免疫细胞的活性。

因此，深入探讨在肿瘤微环境中肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用，阐明TAM在微环境中功能变化的分子机制，以发挥巨噬细胞的积极作用，激活其抗肿瘤活性，将可能为未来肿瘤生物治疗提供新的线索。

尽管肿瘤与巨噬细胞的研究已经有了很大的进展，有关这些细胞的分泌蛋白质的报道也频见于文献，人们在这个领域的认知仍然差强人意。

我们以为，大致有三个方面亟待加大研究的深度和力度。

第一，目前有关肿瘤分泌蛋白质的研究大都关注于单种细胞或癌组织的分泌分子，忽略了癌细胞和其相关细胞实际上生活在一个具体的微环境中，这些细胞的基因表达和分泌状态与肿瘤微环境是密不可分的。

第二，现有的文献大都关注于肿瘤细胞或TAM所分泌的某个或某类蛋白，而实际上，在肿瘤微环境中的各种相关细胞所分泌的蛋白是作为一个整体，相互促进表达，分泌及功能的实施，是一个协同的作用，至今却没有任何一个分泌蛋白质的集合的报道。

第三，TAM可分泌大量的基底蛋白质水解酶类或促血管生成的酶类，这些酶类大多属于同一蛋白质家族，但是迄今尚无较为有效的分离和鉴定手段较全面地了解它们的分泌和功能状态，也就无法从这些关键分子出发更为深刻地了解肿瘤细胞和TAM之间的相互作用是如何促进肿瘤的发生发展的。

研究目标

为了全面了解实体肿瘤的癌细胞与TAM之间的相互作用，主要是它们的分泌蛋白质组的构成以及这些蛋白质对癌细胞和巨噬细胞的作用，我们将以结肠癌细胞及其TAM为研究对象，开展如下三个方面的研究：

1）定性及定量研究TAM的肿瘤分泌蛋白质组，2）结肠癌细胞分泌蛋白质对巨噬细胞蛋白质组和功能的影响，和3）TAM分泌蛋白质对结肠上皮细胞和结肠癌细胞的蛋白质组和功能的影响。

研究内容

1.TAM细胞的分离、培养和多维细胞共培养体系的构建

1.1正常巨噬细胞和TAM细胞系培养

我们将选用半悬浮Ana-1细胞为C57小鼠巨噬细胞系，28SC细胞为人巨噬细胞系。

两个细胞系均用RPMI1640+10%FBS培养。

在TGF-β1的刺激下，巨噬细胞可转化为TAM。

1.2体内正常巨噬细胞和TAM细胞的分离和培养

1.2.1体内正常小鼠巨噬细胞分离和培养

取6周左右的C57小鼠，腹腔注射1毫升无菌的巯基乙酸肉汤，3-4天后处死动物，用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640，1%小牛血清培养液中，用无菌注射器将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。

用含20%-40%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成2x106-4x106/ml的浓度。

以每平方厘米2x106-4x106个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到培养皿中。

37℃5%CO2培养24小时。

用CD14（巨噬细胞特异抗原）抗体做免疫组织化学染色的实验来检验所得巨噬细胞的纯度。

1.2.2TAM的分离和培养

用无菌的PBS洗涤肿瘤组织，肿瘤碎片孵育于含有1mg/ml胶原蛋白酶I的PBS中1小时，将消化过的组织滤过70μm孔径的滤网。

将滤液离心得到沉淀，然后将沉淀悬浮于含有25ng/mlM-CSF的MEM/FBS中培养。

在培养细胞24小时后应进行CD14免疫组织化学检验。

1.3结肠癌细胞与TAM的共培养

将小鼠结肠癌细胞CT26或人结肠癌细胞CoCa-2接种在双层共同培养板的下层，转化的Ana-1、28SC或肿瘤组织中分离的TAM接种于共同培养板的上层（TAM:

结肠癌细胞=10:

1）在RPM1-1640培养液中培养。

2.TAM细胞分泌蛋白质亲和富集技术的建立

2.1TAM分泌糖蛋白质的亲和富集

经内质网-高尔基体分泌途径的经典分泌蛋白质大多属于糖基化蛋白质，我们将采用Heprin/ConA串联亲和层析的方法富集分泌蛋白质，洗脱的蛋白质置于SDS-聚丙烯酰胺胶内，经反复脱水和水化后，然后进行完全的胰蛋白酶消化。

收集消化产生的肽段，经LC-MS/MS分析鉴定分泌蛋白质。

2.2MMPs的定量蛋白质组分析

据已有的报道，TAM可释放多种细胞因子和蛋白酶类，其中基质金属蛋白酶（MatrixMetalloProteinases,MMP）是一种主要的蛋白酶。

然而，目前各家实验室报道的TAM相关的MMP大相径庭。

我们认为，造成这种局面的一个重要原因是缺乏统一的可准确定量的MMP测定方法。

在本课题中，我们提出基质金属蛋白酶的组织抑制剂（TissueInhibitorsofMetalloProteinases,TIMP）亲和层析和高精度质谱仪相结合的策略，试图精确定量MMP蛋白质组。

哺乳动物的TIMP均含有大约125氨基酸的N-端和65氨基酸的C-端，其中N-端以1:

1的比例与MMPs相结合，而TIMP-1能够广泛地与各种MMPs相结合。

基于这种特性，我们将制备重组小鼠和人TIMP-1蛋白质，然后将TIMP-1重组蛋白质结合于Sepharose树脂，制作成为MMP亲和层析柱。

分泌蛋白质与MMP亲和树脂相孵育之后，其中的MMPs可望结合于亲和树脂，MMPs以高盐或酸性溶液洗脱，最后，采用质谱仪鉴定所结合的MMP蛋白质，以MRM技术定量测定差异的MMPs。

2.3TAM分泌多肽的亲和富集

为了检测在细胞培养液中可能存在的多肽或蛋白酶解产物，我们将采用二步磁珠亲和富集技术收集细胞培养液中的多肽。

首先，用ConA/WGA磁珠将培养液中含有糖链的多肽富集下来，然后用RP磁珠富集其他的多肽类。

洗脱吸附于磁珠上的肽段，运用LC-MS/MS测定和DeNovo分析，鉴定肽段的氨基酸序列。

3.正常巨噬细胞和TAM细胞的分泌蛋白质组分析

3.1正常小鼠巨噬细胞和TAM分泌蛋白质组比较分析

该实验将分为两个小组，1）小鼠正常巨噬细胞Ana-1和相对应的转化的TAM；2）在小鼠体内分离巨噬细胞和从小鼠结肠癌组织中分离TAM。

这些细胞在含有10%FBS的RPMI-1640培养液后中，收集所有悬浮和贴壁细胞，再用不含血清的RPMI-1640培养72小时，每隔24小时收集一次细胞培养基。

冻干法浓缩分泌蛋白质。

用SDS-聚丙烯酰胺变性分泌蛋白质，加入胰蛋酶完全消化蛋白质。

蛋白质组分析将分为二个方面进行：

1）对于小鼠巨噬细胞和TAM各自的分泌蛋白质组，我们将采用两维HPLC的方法分离消化所产生的肽段，即第一维采用反相色谱柱吸附肽段，NH4OH，pH10，的乙腈梯度溶液洗脱肽段，第二维仍采用反相色谱柱吸附肽段吸附肽段，但是用TFA，pH2.5，的乙腈梯度溶液洗脱肽段。

肽段送入VelosOrbitTrap质谱仪来鉴定肽段和蛋白质。

2）对于小鼠正常巨噬细胞与TAM之间的差异蛋白质组，我们将用iTRAQ试剂分别标记这两种细胞的分泌蛋白质所产生的消化肽段，然后等量混合分别，运用三重四极杆质谱仪定量分析两种肽段混合物的定量差异。

3.2正常人巨噬细胞系和人TAM的分泌蛋白质比较分析

采用人巨噬细胞28SC与其转化的TAM为分析对象。

基本蛋白质组分析策略同上所述。

4.结肠癌与TAM共培养体系的蛋白质组分析

4.1构建结肠癌与TAM共培养体系的蛋白质谱

由TAM分泌的蛋白刺激肿瘤细胞后，肿瘤细胞必然做出相应的反应，其分泌的蛋白质也会发生相应的变化，这些变化又会刺激TAM的分泌，如此造成一个恶性的循环。

那么TAM与肿瘤细胞相互作用后，分泌蛋白质又会发生怎样的变化呢？

我们将采用小鼠结肠癌细胞CT26和小鼠TAM细胞Ana-1，人结肠癌细胞Caco-2和人TAM细胞28SC，来开展这两种细胞的互作实验。

用培养TAM的培养基来培养结肠癌细胞，然后收集肿瘤细胞培养上清，分析肿瘤细胞分泌的蛋白质；或在Transwell培养小室中培养TAM和肿瘤细胞，让TAM与肿瘤细胞受到共培养分泌产物的影响，分别收集其培养上清，分析TAM和肿瘤细胞分泌的蛋白质。

然后将此蛋白质分泌谱与单独培养TAM或肿瘤细胞的培养基中的分泌蛋白进行比较，得到TAM与肿瘤细胞相互作用后特异改变的分泌蛋白质。

4.2结肠癌与TAM共培养体系的比较蛋白质组分析

将CT26与Ana-1或Caco-2与28SC进行二元培养，在培养的不同时期，或者不同比例的培养系统中，利用免疫磁珠法分离培养系统中的肿瘤细胞和TAM细胞，然后采用SILAC标记技术定量比较各个细胞的分泌蛋白质对总分泌蛋白质的贡献。

同时采用磷酸化蛋白质/肽段富集结合蛋白质组学方法分别分析经过共培养后的结肠癌细胞和TAM细胞与它们单独培养后细胞内蛋白质表达水平和磷酸化蛋白质的差异。

4.3构建三元共培养体系的蛋白质谱

微环境是由除肿瘤细胞外多种细胞组成的，其中包括巨噬细胞和成纤维细胞。

这些细胞之间存在怎样的相互作用呢？

这些细胞相互作用后对肿瘤细胞的分泌蛋白质又有何影响呢？

我们将选用小鼠结肠癌细胞CT26、TAM细胞Ana-1、TAF细胞，或人结肠癌细胞Caco-2、TAM细胞28SC、TAF细胞。

对于小鼠细胞，在Transwell培养小室下层培养CT26，在其下层培养TAF，在上下各层中加入等量的Ana-1；对于人细胞，在下层培养Caco-2，上层培养CCD-18Co，在上下各层中加入28SC细胞。

整个Transwell培养小室置于慢速转动系统中，以防止巨噬细胞的积聚。

三元系统的分泌蛋白质组测定如图3.1所述。

并将三元分泌蛋白质组与单独培养TAM、TAF或肿瘤细胞的培养基中的分泌蛋白进行比较，可望得到TAM、TAF与肿瘤细胞相互作用后特异改变的分泌蛋白质。

4.4三元共培养体系的比较蛋白质组分析

在三元培养的不同时期，或者不同比例的培养系统中，采用SILAC技术定量测定各种细胞的分泌蛋白质在总分泌蛋白质中的相对丰度。

5.结肠癌细胞或TAM分泌蛋白质对正常巨噬细胞的功能影响

5.1鉴定诱导巨噬细胞向TAM转化的新的细胞因子

我们已知在IL-4、IL-8、IL-10、IL-13、TGF-β、类固醇和PGE2的刺激下，巨噬细胞转向TAM。

很多报道也是应用这些因子处理巨噬细胞来研究TAM的功能。

除了这些常见因子，是否还有其他细胞因子可以起到同样的作用呢？

将正常结肠细胞的培养液和结肠癌细胞的培养液分别培养正常巨噬细胞，根据TAM具有低表达carboxypeptidaseM、CD51、TNF-α，而持续性高表达IL-1、IL-6的特性，检测结肠癌细胞的培养液是否可以诱导巨噬细胞向TAM的转化。

如上述所建立的分泌蛋白亲和富集方法分别收集正常结肠细胞的培养液和结肠癌细胞的培养液，应用蛋白质组学的方法（iTRAQ、ICAT、SILAC）比较正常细胞和相应的结肠癌细胞培养基中的分泌蛋白，那些在癌症组表达上调的分泌蛋白，很可能就是促进巨噬细胞向TAM转换的新的诱导因子，或者是结肠癌特有的诱导因子。

将所得的候选诱导因子加入细胞培养液中培养巨噬细胞，同样的通过检测巨噬细胞