黄酮标准曲线绘制实验报告.docx
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黄酮标准曲线绘制实验报告
黄酮标准曲线绘制实验报告
黄酮标准曲线绘制的实验报告1.总黄酮的测定11.1实验仪器电子天平AR2140;紫外可见分光光度计UV2754;型数控超声波清洗器KQ3200DB;超级恒温槽;RotavaporR200旋转蒸发仪;FD21C250冷冻枯燥机21.2试剂及药品芦丁标准品硝酸铝国产分析纯（配成5%）亚硝酸钠国产分析纯（配成10%）氢氧化钠国产分析纯配成（配成1mol/L）95%乙醇，无水乙醇国产分析纯（配成60%乙醇50%乙醇）DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）Vc（Ascrobicacid，维生素C，抗坏血酸）没食子酸对照品：
基准纯。
大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔31.3实验步骤：
及波长确实定样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。
根据查阅文献总黄酮在
波长为510处吸收值最大。
精密称取120℃枯燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。
及绘制标准曲线精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于10mL容量瓶中，并定容至刻度线。
得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol/L氢氧化钠溶液4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,xx）。
（以试剂空白做参比）以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。
用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。
序号浓度（ug/ml）吸光度1002150.1803300.3494450.5465600.7276750.8847901.063表1-1：
芦丁标准曲线测定数据图1-2：
芦丁标准曲线根据查阅文献总黄酮在波长为510处吸收值最大。
取黄酮提取液，取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线那么稀释5倍。
取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。
其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol氢氧化钠溶液
4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510处测定其吸光度。
代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。
经换算后得样品中总黄酮含量。
样品总黄酮含量（mg/g）=X*n*V1/（V*W）式中：
X—测出的浓度，mg/mL;（直接代入，不用换算。
）n—稀释倍数，量纲为1;VI—样液总体积，mL;V—测定时取样体积，mL;W—样品质量，g。
2.总分含量的测定2.1实验仪器ALZO4型电子分析天平:
梅特勒一托利多仪器;DELA犯O型pH计:
梅特勒一托利多仪器;723可见分光光度计:
菩华科技仪器;DK一512型电热恒温水浴锅:
森信实验仪器;容量瓶（250mL，10OmL，25mL）、比色管管（10mL）;烧杯、移液管、吸耳球。
22.2试剂及药品没食子酸对照品：
基准纯，购于分析试剂厂，置50℃真空枯燥箱真空中枯燥4h。
乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
22.3Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量3.3.1Folin—Ciocalteu试剂的配制称取20g钨酸钠和5g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140ml蒸馏水溶解，参加10ml85％的
磷酸溶液和20ml浓盐酸，文火回流10h，然后参加3g硫酸锂及15ml双氧水，加热沸腾15min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。
冷却，移入250ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。
准确称取15．00mg枯燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。
将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，参加2ml福林试剂，充分摇匀，参加0．75ml7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。
振荡一下，静置2h（Guo&Wei,xx）。
同时制作空白管。
为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。
于765波长处测定吸光度值。
2.3.3标准曲线的制备以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。
用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。
表3-1：
没食子酸标准曲线测定数据图3-1：
没食子酸标准曲线取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线那么稀释5倍。
取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，参加2ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。
振荡一下，静置2h。
同时制作空白管。
为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。
于765波长处测定吸光度值。
总酚酸含量计算：
序号浓度（ug/ml）吸光度（WL765.0）000130.132260.284390.4114120.5825150.7126180.8437211.013
多酚含量（mg/100g）=100g0.5X（mg）?
?
?
）总酚酸称样量（稀释倍数33..去除DPPH·的能力的测定3.1.实验仪器、药品及试剂2.1.1实验仪器ALZO4型电子分析天平:
梅特勒一托利多仪器;DELA犯O型pH计:
梅特勒一托利多仪器;723可见分光光度计:
菩华科技仪器;DK一512型电热恒温水浴锅:
森信实验仪器;容量瓶（250mL，10OmL，25mL）、比色管（10mL）;烧杯、移液管、吸耳球。
DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）；Vc（Ascrobicacid，维生素C，抗坏血酸）为分析纯；无水乙醇，蒸馏水配制0.06mMDPPH试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。
准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，那么可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。
从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再参加3.9ml的DPPH，反响30min,在517测出吸光值（Thoo&Ho,xx），用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。
去除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100%式中，Ac：
0.1mL无水乙醇加3.9mLDPPH溶液的吸光度；
Ai：
0.1mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度。
表3-1：
VC标准曲线测定数据以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。
用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。
图3-1：
VC含量与吸光度的关系图3-1：
VC含量与去除率的关系取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线那么稀释2.5倍。
取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL试管中，再分别参加配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反响30min后，分别在517处测定其吸光度。
代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值。
经换算后得样品自由基去除率。
4.去除ABTS++自由基能力的测定4.1ABTS++自由基的配制准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；序号C（mmol/L）吸光度去除率/%00010.20.52914.9220.40.42430.9030.60.3246.7340.80.20963.62510.1178.6961.20.0292.39
7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反响12~16h，形成ABTS+自由基储藏液。
该储藏液在室温，避光的条件下稳定。
用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。
24.2标准曲线的绘制（Zhu&Lian,xx），用无水乙醇作空白，重复三组。
去除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100%式中，Ac：
0.1mL无水乙醇加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度；Ai：
0.1mL待测液加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度。
表4-1：
Vc浓度与吸光值和去除率的数据图4-1Vc浓度与其吸光值的关系图4-2：
Vc浓度与其去除ABTS能力的关系5.复原能力的测定5.1实验试剂磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.60.2mol/l）;K3Fe（）6溶液（配成1%）;三氯乙酸（配成10%）；FeCl3（配成0.1%）；没食子酸无水乙醇序号C（mmol/l）吸光度去除率/%100.0020.10.5712.0430.20.49323.9240.30.42234.8850.40.35145.8360.50.27657.4170.60.269.1480.70.11881.7990.80.03594.60
25.2标准曲线的绘制磷酸盐缓冲溶液（pH6.60.2mol/L）：
准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。
准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液（pH6.60.2mol/L）。
用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml，准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次参加PH6.6磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和1%K3Fe（）6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50℃水浴20min,再参加10%的三氯乙酸2.5ml。
于（3000r/min）离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸馏水和0.1%的FeCl30.5ml混合均匀，静置10min在700处测定吸光值，通过在700下的吸收值来测量提取物的复原能力，吸光值越高说明复原力越强，EC50的计算是吸光值为0.5时的浓度（Roy&Laskar,xx）。
表5-1：
没食子酸的质量浓度和吸光值的数据图5-1：
没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系6.超氧自由自测定6.1实验试剂11实验试剂Tris-Hcl缓冲液（配制PH8.2050mmol/L）Testsetgallicacidconntrationug/mlAbsorbency1002500.5931001.141501.52752002.07362502.57973003.1
邻苯三酚（配制3mmol/L）VC无水乙醇6.2标准曲线的绘制6.2..1试剂的配制Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液：
取0.6057g三羟甲基氨基甲烷（Tris），蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/L盐酸溶液；分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液。
邻苯三酚：
配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。
精密称取Vc标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯洁水溶解后定容至100mL容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。
将0.3mg/mL的Vc标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18mg/mL,0.21mg/mL,0.24mg/mL,0.27mg/mL,0.3mg/mL的溶液，分别参加4.5mL的Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液于10mL的试管中，再参加1mL不同浓度样品或待测液，25℃反响10min，再参加25℃预热的邻苯三酚0.1mL（3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制），迅速摇匀，于325出测定，参加邻苯三酚即开始计时，每隔30s读取一次，至5min，做好记录。
邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品，Tris-HCl缓冲溶液作空白。
去除率%=[（△Ac-△Ai）/△Ac]×100%式中，△Ac：
邻苯三酚自氧化速率；
△Ai：
参加待测液后邻苯三酚自氧化速率。
表6-1：
Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据图6-1：
Vc的质量浓度与其去除超氧自由基关系吸光值自氧化速率抑制率序号时间min1st5th邻苯三酚0.1ml0.1420.4110.067251浓度ug/ml000002300.0320.2460.0535020.453600.0150.1790.0410039.034900.0120.130.0295056.1351200.0070.0740.0167575.0961500.0060.0250.0047592.94
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