黄酮标准曲线绘制实验报告.docx

1、黄酮标准曲线绘制实验报告黄酮标准曲线绘制实验报告 黄酮标准曲线绘制的实验报告 1. 总黄酮的测定 1 1 .1 实验仪器 电子天平AR2140; 紫外可见分光光度计UV2754; 型数控超声波清洗器KQ3200DB; 超级恒温槽; Rotavapor R200 旋转蒸发仪 ; FD21C250 冷冻枯燥机2 1. 2 试剂及药品 芦丁 标准品 硝酸铝 国产分析纯（配成 5 %） 亚硝酸钠 国产分析纯（配成 10 %） 氢氧化钠 国产分析纯配成（配成 1mol/L） 95%乙醇，无水乙醇 国产分析纯（配成 60%乙醇 50%乙醇） DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydraz

2、yl，二苯代苦味肼基自由基） Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸） 没食子酸对照品：基准纯。 大青叶子 采摘于海南大学东坡湖畔 3 1.3 实验步骤： 及波长确实定 样品 60烘干粉碎机粉碎，过 20 目筛，装入试剂瓶中备用。根据查阅文献总黄酮在 波长为 510 处吸收值最大。 精密称取 120 枯燥至恒重的芦丁标准样品 37.5mg 置于 100mL 烧杯中,用 60%乙醇溶解后定容至 25mL 容量瓶中,摇匀，即可得 1.5mg/mL 的芦丁标准溶液。 及绘制标准曲线 精密吸取芦丁标准溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL ,分别置于 10mL

3、 容量瓶中，并定容至刻度线。得到 0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml 的标准品溶液，分别取 1ml 到试管中各加 5 %亚硝酸钠溶液 0.3mL 摇匀,放置 6min ,加 10%硝酸铝溶液 0.3mL 摇匀,放置 6min ,加 1mol /L 氢氧化钠溶液 4mL ,再用 60%乙醇溶液稀释至刻度,放置 15min 后,分别在 510 处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,xx）。（以试剂空白做参比） 以吸光度 A 为纵坐标,浓度 c 为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得 c

4、与 A 的线性回归方程以及相关系数 R2 。 序号 浓度（ug/ml） 吸光度 1 0 0 2 15 0.180 3 30 0.349 4 45 0.546 5 60 0.727 6 75 0.884 7 90 1.063 表 1-1： 芦丁标准曲线测定数据 图 1-2：芦丁标准曲线 根据查阅文献总黄酮在波长为 510 处吸收值最大。取黄酮提取液， 取提液 2ml 至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线那么稀释5倍。取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用 60%的乙醇定容，作为参比溶液。其余各份各加 5%亚硝酸钠溶液0.3mL 摇匀,放置 6min ,加 10%硝酸

5、铝溶液 0.3mL 摇匀,放置 6min ,加 1mol 氢氧化钠溶液 4mL ,再用 60%乙醇溶液稀释至刻度,放置 15min 后,分别在 510 处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品中总黄酮含量。 样品总黄酮含量(mg/g)=X*n*V 1 /( V *W) 式中：X测出的浓度，mg/ mL;（直接代入，不用换算。） n稀释倍数，量纲为 1; V I 样液总体积，mL; V测定时取样体积，mL; W样品质量，g。 2. 总分含量的测定 2.1 实验仪器 ALZO4 型电子分析天平: 梅特勒一托利多仪器; DELA 犯 O 型

6、pH 计: 梅特勒一托利多仪器; 723 可见分光光度计: 菩华科技仪器; DK 一 512 型电热恒温水浴锅: 森信实验仪器; 容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管管(10mL); 烧杯、移液管、吸耳球。 2 2.2 试剂及药品 没食子酸对照品：基准纯，购于 分析试剂厂，置50真空枯燥箱真 空中枯燥4 h。乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。 2 2 .3 Folin Ciocalteu 比色法测定总酚酸含量 3.3.1 FolinCiocalteu试剂的配制 称取20 g钨酸钠和5 g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140 ml蒸馏水溶解，参加10ml 85的 磷酸溶液和20 m

7、l浓盐酸，文火回流10 h，然后参加3 g硫酸锂及15 ml双 氧水，加热沸腾15 min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。冷却，移入250 ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4冰箱保存。 准确称取1500 mg枯燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。 将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，参加2 ml福林试剂，充

8、分摇匀，参加075ml 7.5碳酸钠溶液混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置2h(Guo&Wei,xx)。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于765 波长处测定吸光度值。 2.3.3标准曲线的制备 以吸光度 A 为纵坐标,浓度 c 为横坐标,绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性拟合,得 c 与 A 的线性回归方程以及相关系数 R2 。 表 3-1：没食子酸 标准曲线测定数据 图 3-1：没食子酸 标准曲线 取 提 液 2ml 至 10ml 的比色管中用60%的乙醇定容至刻度 线那么稀释 5 倍。取稀释后溶液 1ml 四份,分 别置于 10mL 比色管

9、中，参加2 ml福林试剂， 充 分 摇 匀 ， 加 入075ml 7.5碳酸钠溶 液混匀，以蒸馏水稀释至刻度。振荡一下，静置 2h。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。于 765 波长处测定吸光度值。 总酚酸含量计算： 序号 浓度（ug/ml） 吸光度（WL765.0） 0 0 0 1 3 0.132 2 6 0.284 3 9 0.411 4 12 0.582 5 15 0.712 6 18 0.843 7 21 1.013 多酚含量（mg/100g）= 100g 0.5X(mg)?） 总酚酸称样量（稀释倍数 3 3. . 去除 DPPH 的能力的测定

10、 3.1. 实验仪器、药品及试剂 2.1.1 实验仪器 ALZO4 型电子分析天平: 梅特勒一托利多仪器; DELA 犯 O 型 pH 计: 梅特勒一托利多仪器; 723 可见分光光度计: 菩华科技仪器; DK 一 512 型电热恒温水浴锅: 森信实验仪器; 容量瓶(250mL，10OmL，25mL)、比色管(10mL); 烧杯、移液管、吸耳球。 DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）； Vc（Ascrobic acid，维生素 C，抗坏血酸）为分析纯； 无水乙醇，蒸馏水 配制 0.06mMDPPH 试剂，放入冰箱 4进行冷藏，以备用。 准

11、确称取 17.6mgVc 到 100mL 的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于 50mL 的容量瓶中定容至刻度线及可以得到 2mmol/L 的母液，分别量 1、2、3、4、5、6ml 至 10ml 的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，那么可以得到 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L 的溶液。从以上比色管中分别取 0.1ml 溶液置于试管中再参加 3.9ml的 DPPH，反响 30min,在 517 测出吸光值(Thoo&Ho,xx)，用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。 去除率=(Ac-Ai)/Ac1

12、00% 式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL DPPH 溶液的吸光度； Ai：0.1 mL 待测液加 3.9mLDPPH 溶液的吸光度。 表 3-1：VC标准曲线 测定数据 以 吸 光度A 为纵 坐 标 , 浓度 c 为横 坐 标 , 绘制标准曲线。用 最小二乘法进行线性拟合,得 c 与 A 的线性回归方程以及相关系数 R2 。 图 3-1：VC 含量与吸光度的关系 图3-1：VC 含量与去除率的关系 取提液 4ml 至 10ml 的比色管中用 60%的乙醇定容至刻度线那么稀释 2.5 倍。取稀释后溶液 0.1mL 三份,分别置于 10mL 试管中，再分别参加配置好的 DPPH 溶

13、液 3.9mL,摇匀，反响30min 后，分别在 517 处测定其吸光度。代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以 Vc 为参比）,三次结果取平均值。经换算后得样品自由基去除率。 4. 去除 ABTS+ + 自由基能力的测定 4.1ABTS+ + 自由基的配制 准确称取 0.19215gABTS 于 50mL 的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度 7mmol/L；序号 C（mmol/L） 吸光度 去除率/% 0 0 0 1 0.2 0.529 14.92 2 0.4 0.424 30.90 3 0.6 0.32 46.73 4 0.8 0.209 63.62 5 1 0.11 78.69 6 1

14、.2 0.02 92.39 7mmol/LABTS + .与 2.45mmol/L 的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反响 1216h，形成 ABTS + 自由基储藏液。该储藏液在室温，避光的条件下稳定。用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长 734 处测得其吸光度为 0.7000（0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱 4进行冷藏，以备用。 2 4.2 标准曲线的绘制 (Zhu&Lian,xx)，用无水乙醇作空白，重复三组。 去除率=(Ac-Ai)/Ac100% 式中，Ac：0.1 mL 无水乙醇加 3.9mL ABTS + 自由基溶液的吸光度； Ai：0.1 mL 待测液

15、加 3.9mLABTS + 自由基溶液的吸光度。 表 4-1：Vc 浓度 与吸光值和去除率的数据 图 4-1Vc 浓度与 其吸光值的关系 图 4-2：Vc 浓度 与其去除 ABTS能力的关系 5. 复原能力的 测定 5.1 实验试剂 磷酸盐缓冲溶液（配成 PH6.6 0.2mol/l）; K 3 Fe() 6 溶液（配成 1%）; 三氯乙酸（配成 10%）； FeCl 3 （配成 0.1%）； 没食子酸 无水乙醇 序号 C（mmol/l） 吸光度 去除率/% 1 0 0.00 2 0.1 0.57 12.04 3 0.2 0.493 23.92 4 0.3 0.422 34.88 5 0.4

16、0.351 45.83 6 0.5 0.276 57.41 7 0.6 0.2 69.14 8 0.7 0.118 81.79 9 0.8 0.035 94.60 2 5.2 标准曲线的绘制 磷酸盐缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)：准确称取 7.16g 的磷酸氢二钠至 100mL 的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于 100mL 的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到 0.2mol/L 的磷酸氢二钠，同样的方法配制 0.2mol/L 的磷酸二氢钠。准确量取 37.5mL 的 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液和 62.5mL 的 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用 pH 校正既可以得到磷酸盐

17、缓冲溶液(pH6.6 0.2mol/L)。 用没食子酸做标准曲线其浓度范围在 50300ug/ml，准确称取 50mg 没食子酸到 100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到 0.5mg/ml 的母液，在分别取 1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL 至 10mL 的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到 50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml 的溶液，取不同浓度的待测液或样品 1ml 于试管中，依次参加 PH6.6 磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和 1% K3Fe()6 溶液

18、 2.5ml 后混合均匀，混合液于 50水浴 20min,再参加 10%的三氯乙酸 2.5ml。于（3000r/min）离心 10min,取 2.5ml 的上清液再依次加 2.5ml 蒸馏水和 0.1%的 FeCl3 0.5ml 混合均匀，静置 10min 在 700 处测定吸光值，通过在 700 下的吸收值来测量提取物的复原能力，吸光值越高说明复原力越强，EC 50 的计算是吸光值为 0.5 时的浓度（Roy&Laskar,xx）。 表 5-1：没食子酸的质量浓度和吸光值的数据 图 5-1：没食 子酸的质量浓度与其吸光 值的关系 6. 超氧自 由自测定 6.1 实验试 剂 1 1 实验试剂

19、Tris-Hcl 缓冲液（配制 PH8.20 50mmol/L） Test set gallic acid con ntration ug/ml Absorbency 1 0 0 2 50 0.59 3 100 1.1 4 150 1.527 5 200 2.073 6 250 2.579 7 300 3.1 邻苯三酚(配制 3mmol/L) VC 无水乙醇 6.2 标准曲线的绘制 6.2.1 试剂的配制 Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液：取 0.6057g 三羟甲基氨基甲烷（Tris），蒸馏水溶解定容至 50mL 容量瓶；取 0.309mL 分析纯盐酸溶液至 100m

20、L 的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得 0.1mol/L 盐酸溶液；分别取配置好的 Tris50mL 和 0.1mol/L 盐酸溶液22.9mL 于 100mL 容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用 pH 计进行校正即可以得到 Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液。邻苯三酚：配制 10mmol/L 的稀盐酸，取 0.310mL 分析纯盐酸溶液至 1000mL 的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸 0.0095g，至 25mL的容量瓶中用 10mmol/L 的稀盐酸溶液定容至刻度线。 精密称取 Vc 标准样品 0.0300g 置于 100mL 烧杯中,用纯洁水溶解后定容至

21、 100mL 容量瓶中,即可得 0.3mg/mL 的 Vc 标准溶液。 将 0.3mg/mL 的 Vc 标准溶液分别配制成 0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18 mg/mL,0.21 mg/mL,0.24 mg/mL,0.27 mg/mL,0.3 mg/mL 的溶液，分别参加 4.5mL 的 Tris-HCl（pH8.2 50mmol/L）缓冲溶液于 10mL 的试管中，再参加 1mL 不同浓度样品或待测液，25反响 10min，再参加 25预热的邻苯三酚 0.1mL（3mmol/L 用 10mmol/L

22、 的盐酸配制），迅速摇匀，于 325 出测定，参加邻苯三酚即开始计时，每隔 30s 读取一次，至 5min，做好记录。邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品，Tris-HCl 缓冲溶液作空白。 去除率%=(Ac-Ai)/Ac100% 式中，Ac：邻苯三酚自氧化速率； Ai：参加待测液后邻苯三酚自氧化速率。 表6-1： Vc的质 量浓度 与吸光 值和抑 制率的 的数据 图6-1： Vc的质 量浓度与其去除超氧自由基关系 吸光值 自氧化速率 抑制率 序号 时间 min 1st 5th 邻苯三酚0.1ml 0.142 0.411 0.06725 1 浓度 ug/ml 0 0 0 0 0 2 30 0.032 0.246 0.05350 20.45 3 60 0.015 0.179 0.04100 39.03 4 90 0.012 0.13 0.02950 56.13 5 120 0.007 0.074 0.01675 75.09 6 150 0.006 0.025 0.00475 92.94 模板,内容仅供参考