呼吸道感染IgM九项联检试剂使用说明终稿.docx
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呼吸道感染IgM九项联检试剂使用说明终稿
呼吸道感染IgM九项联检试剂盒（间接免疫荧光法）
说明书【产品名称】
通用名称：
呼吸道感染IgM九项联检试剂盒（间接免疫荧光法）
英文名称：
PNEUMOSLIDEIgM
商品名称：
PNEUMOSLIDEIgM【包装规格】
10人份/盒【预期用途】
采用间接免疫荧光法（IFA），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM抗体，可检的病原体包括：
嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、
2和3型。
已报道的非典型性肺炎的病原体有很多，其中最常见的有：
嗜肺军团菌
人最易感染的是嗜肺军团菌血清1型，非典型性肺炎常伴随有全身症状。
10%的肺炎是由嗜肺军团菌血清1型引起的。
在血清学诊断中，间接免疫荧光法（IFA）是唯一的标准技术。
肺炎支原体
肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见，由于很难将其固定在载玻片上，因此先将肺炎支原体抗原固定在细胞中。
Q热立克次体
Q热是由Q热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或心内膜炎。
血清学诊断中，IFA检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。
肺炎衣原体肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。
在老年人中发病率较高，它所引起的肺炎占所有肺炎病例的10%。
微量免疫荧光法（MIF）是最灵敏和最特异的诊断方法。
腺病毒
腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和轻度呼吸道感染。
呼吸道合胞病毒
呼吸道合胞病毒（RSV）是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发流行。
流感病毒
它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。
由于它易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。
因此，实验室诊断就显得非常重要。
副流感病毒
副流感病毒1、2和3型在2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎（哮吼）。
3型具有流行性，1和2型具有地域性。
【检测原理】
间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。
样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。
在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。
用免疫荧光显微镜观察结果。
【主要组成成份】
除PBS外，所有试剂均可直接使用。
为了易于识别，所有试剂均有一个给定的编号。
在操作骤中，写明了每一步所使用试剂的编号。
1载玻片：
10片（10孔/片），含有下列抗原：
1.嗜肺军团菌血清1型（悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）
2.McCoy细胞中的肺炎支原体
3.Q热立克次体II期（悬浮于0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌聚集）
4.肺炎衣原体（原生小体）
5.HEp-2细胞中的腺病毒
6.HEp-2细胞中的呼吸道合胞病毒
7.LLC-MK2细胞中的甲型流感病毒
8.LLC-MK2细胞中的乙型流感病毒
9.LLC-MK2细胞中副流感病毒1、2和3型
10.质控孔。
除了嗜肺军团菌，载玻片中的所有抗原都是从细胞培养物中获得。
每一个病毒孔
里都含有1%~15%用甲醛灭活的感染细胞，无感染的细胞用丙酮固定。
2PBS：
1瓶，pH7.2PBS粉末，用1L蒸馏水溶解。
3阳性质控：
500μL阳性质控血清，含叠氮钠。
4阴性质控：
500μL阴性质控血清，含叠氮钠。
5MFITC标记的抗人IgM结合物：
2x1.1mL，荧光素标记的抗人IgM磷酸缓冲液，含有伊文斯蓝、叠氮钠和蛋白稳定剂。
6封闭介质：
3mL，甘油缓冲液，含叠氮钠。
7抗人IgG球蛋白（吸附剂）：
1x1.5mL（羊抗人IgG，含叠氮钠）。
需要但未提供的材料：
1.精确的微量移液器
2.恒温培养箱
3.蒸馏水
4.24x60mm盖玻片
5.湿盒
6.荧光显微镜以及制造商推荐的滤光片
【储存要求及有效期】
2~8℃储存。
不要使用超出标签上有效期的试剂。
未拆封的试剂盒2~8℃储存可
稳定至标示有效期的月末。
拆封后试剂的储存
试剂
稳定性和储存
溶解后的PBS
2-8oC4个月，在有效期内使用
其它组分
参照包装标签的有效期（2-8oC储存）
试剂的稳定性及操作在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。
仅使用试验所需量的吸附剂、PBS、质
控血清和结合物溶液，剩余的试剂不要倒回瓶中。
PBS溶解后储存在2~8oC，如出现浑浊请勿使用。
对于试剂盒内试剂的不正确操作，VIRCELL,S.L.将不对其试验结果负责。
【适用仪器】
荧光显微镜
【注意事项】
1.仅用于体外诊断。
仅限专业人员使用。
2.仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。
只有PBS、
吸附剂、封闭介质和载玻片可与其他批次VIRCELLIFA试剂盒通用，其它组分同批次可以混用。
3.每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。
4.包装如有损坏请勿使用。
5.切勿用嘴吸移液管加样。
6.本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人源性物质。
尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为HBsAg、HCV抗体和HIV抗体阴性，质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。
孔内包被的经灭活
*实验前准备
只有PBS需要预先配制。
将试剂2中的成分加入1L蒸馏水中，摇匀直止完全溶解。
配好后储存在2-8oC。
的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型，也仍应视为具有潜在感染性并小心处置。
目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存在，因此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置，应遵守当地关于临床废弃物处理的法规。
7.结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度＜0.1%），避免接触酸和
重金属。
8.封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。
9.伊文斯蓝（浓度＜0.1%）是一种致癌物。
请勿接触皮肤和眼睛。
万一接触到该溶液，用水彻底冲洗并到医院检查。
10.仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。
11.载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。
12.显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。
13.不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。
14.每个载玻片只能使用一次。
不要分割，也不要再使用没有用过的孔。
15.试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。
16.吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。
【样本要求】需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。
使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。
血清样本采集后2~8oC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20oC）保存。
不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。
不要使用高血脂或污染的血清。
若样本中含有微粒要离心使之澄清。
【检测方法】
*实验步骤
1.使用前，将所有试剂平衡至室温。
载玻片平衡至室温后再打开。
2.按1:
1比例稀释血清标本，即25μL血清加入25μLPBS2中。
质控血清34不需要稀释。
3.用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：
将30μL稀释后的血清加入150μL吸附剂中，彻底混匀。
质控血清3和4不需吸附剂处理。
处理后的血清要离心除去沉淀，以防干扰检测。
4.在载玻片1的每孔中加15μL吸附剂处理过的血清。
在一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阳性质控3，在另一个载玻片的每孔中加入15μL不稀释的阴性质控4。
5.将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。
6.用PBS2的缓慢水流简单冲洗载玻片1（避免PBS直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在振荡器上轻轻摇动10分钟。
将载玻片在蒸馏水中简单蘸洗。
7.载玻片1自然风干。
8.每孔加入15μL抗人IgMFITC结合物溶液5M（不需稀释）。
9.将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。
10.重复6和7的洗涤步骤。
11.每孔加1小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。
12.尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。
如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8oC不超过24小时。
【内部质量控制】每一批产品在放行前都要经过更加严格的内部质量控制（Q.C.）的检验。
质控材料可溯源到经过内部确认的参考血清盘。
【有效性判断】每一次试验都应设立阳性和阴性质控，以确认试验和试剂盒的有效性。
观察到的荧光模式应为：
阳性质控：
腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核和胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。
阴性质控：
军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。
检测结果的解释】
阳性结果：
可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核和胞浆出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。
阴性结果：
可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。
如果所有细胞或第10孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体，不能判为阳性，应用其他方法进行检测。
当质控孔中无荧光时一定要查明原因。
由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，阳性结果需结合临床症状综合评价。
建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。
呼吸道感染IgG联检试剂（PNEUMOSLIDEIgG）更适合于筛查试验。
对于广泛流行的疾病，可能会在一个标本中出现几个阳性结果。
呼吸道感染IgM联检试剂（PNEUMOSLIDEIgM）由于其高度特异性，是一种非常适用的技术，因为IgM阳性不会超过3个月，但对重复感染灵敏度较低。
近期感染诊断的理想方法是同时使用呼吸道感染IgG联检试剂和呼吸道感染IgM联检试剂：
IgM联检试剂适用于检测成人的第一个标本和儿童的第一、第二个标本，IgG联检试剂适用于检测成人的第二个标本。
与说明书中所列结果不同不能判为阳性。
在初次感染和再次感染的过程中，IgG和IgM抗体有不同的表现方式：
初次感染时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；而再次感染时，在所有的情况下均不出现IgM，因此IgG的检测是唯一有用的诊断方法。
在许多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM一般情况下仅在感染后2—3个月存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。
【检验方法的局限性】
1.本试剂盒用于检测人血清。
2.建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结果。
特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、温育的时间控制对获得准确结果都是很重要的。
3.样本的检测结果应与临床评价以及其他诊断方法结合使用。
4.本检测不能指出感染部位，不能单独使用。
5.抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性。
6.在感染早期采集的样本可能是检测不到IgG的，在这种情况下建议采用IgM检测，或者在14-21天后采集第二个血清样本，并与原标本同时检测来确定是否发生血清转换。
7.婴儿的IgG检测结果要作谨慎解释，因为出生前母体的IgG被动的传递给了胎儿。
对6个月以下的婴儿IgM检测是更为有用感染标志物。
8.单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。
应采集成对样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高。
9.对患有自身免疫性疾病病人的血清，用IFA检测时，支原体、腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒，会在细胞上发生非特异性反应，这些血清不能用本方法评价。
质控孔用于检测这种现象。
在嗜肺军团菌和Q热立克次体中，有时血清会含有与卵抗原反应的抗体，所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。
当出现这种情况时，该血清就不能用IFA进行分析了。
10.未对本检测在疗效随访方面的性能做过评估。
11.除了肺炎外，未对本技术在肺炎衣原体引起的其他疾病方面的性能作过评估。
【产品性能指标】
1.灵敏度和特异性
嗜肺军团菌血清1型
与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测82份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
82
94.4%
98.4%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
肺炎支原体
与一种ELISA试剂盒对照检测62份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
62
96.8%
100.0%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
Q热立克次体
与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
74
100.0%
97.6%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
肺炎衣原体
与另一个商品化的IFA试剂盒对照检测61份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
61
100.0%
98．0%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
腺病毒
与一种ELISA试剂盒对照检测74份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
74
85.7%
97.0%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
呼吸道合胞病毒
与一种ELISA试剂盒对照检测97份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
97
93.8%
100.0%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
甲型流感病毒
与一种ELISA试剂盒对照检测46份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
46
94.1%
96.4%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
乙型流感病毒
与一种ELISA试剂盒对照检测40份血清样本，结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
40
100.0%
96.4%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
副流感病毒1、2和3型
与一种ELISA试剂盒对照检测36份血清样本。
结果如下：
样本数
灵敏度
特异性
IgM
36
100.0%
96.3%
有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。
2.精密度分析内精密度：
在相同实验条件下由同一个操作人员在同一次试验中对3份血清（2份阳性和1份阴性）分别进行5组加样检测。
结果：
滴度变化不超过一个稀释度。
分析间精密度：
在5种不同条件下（不同操作人员或不同试验日期）对3份血清（2份阳性和1份阴性）进行检测。
结果：
滴度变化不超过一个稀释度。
3.交叉反应和干扰嗜肺军团菌血清1型
检测20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和Q热立克次体）、革兰氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌）和抗核抗体阳性血清样本。
肺炎支原体
检测12份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、肺炎衣原体和Q热立克次体）阳性血清样本。
Q热立克次体
检测20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌）、同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。
肺炎衣原体
检测20份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、Q热立克次体和肺炎支原体），同种属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。
腺病毒
检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）阳性血清样本。
呼吸道合胞病毒
检测10份病毒综合病症组（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根据病毒分类（麻疹）阳性血清样本。
甲型流感病毒
检测8份病毒综合病症组（RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性的血清样本。
乙型流感病毒
检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性血清样本。
副流感病毒血清1、2和3型
检测8份病毒综合病症组（RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒）阳性血清样本。
结论
检测结果表明本试剂盒与上述参考品无交叉反应或干扰，从而证实了该试剂盒的特异性反应。
其它干扰研究
对25份类风湿因子阳性血清进行了2种病毒和2种细菌抗原IgG和IgM抗体的检测。
对另外两份血清进行了每种抗原IgG和IgM抗体的检测。
在IgM检测中，用抗IgG抗体对血清进行了吸附处理。
结果显示，吸附剂可以有效避免类风湿因子的干扰。
经验证，吸附剂也可以有效地避免IgG抗体过量造成的假阴性。
【标签符号】
体外诊断用医疗器械
使用有效期
8oC
2oC
储存条件2-8oC
x
可用于检测的次数（规格）
批号
目录号
使用说明书
每个载玻片上反应孔的数量
简明操作程序】
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