呼吸道感染IgM九项联检试剂使用说明终稿.docx

1、呼吸道感染IgM九项联检试剂使用说明终稿呼吸道感染 IgM 九项联检试剂盒（间接免疫荧光法）说明书 【产品名称】通用名称：呼吸道感染 IgM 九项联检试剂盒（间接免疫荧光法）英文名称： PNEUMOSLIDE IgM商品名称： PNEUMOSLIDE IgM 【包装规格】10 人份/ 盒 【预期用途】采用间接免疫荧光法（ IFA ），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的 IgM 抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清 1型、肺炎支原体、 Q热立克次体、肺炎 衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2和 3 型。已报道的非典型性肺炎的病原体有很多，其中最常见

2、的有： 嗜肺军团菌人最易感染的是嗜肺军团菌血清 1 型，非典型性肺炎常伴随有全身症状。 10%的 肺炎是由嗜肺军团菌血清 1型引起的。在血清学诊断中， 间接免疫荧光法 （IFA ）是 唯一的标准技术。肺炎支原体肺炎支原体引起的肺炎在儿童和青少年中最为常见， 由于很难将其固定在载玻片 上，因此先将肺炎支原体抗原固定在细胞中。Q 热立克次体Q 热是由 Q 热立克次体引起的全身疾病，会造成发热、非典型性肺炎、肝炎或 心内膜炎。血清学诊断中， IFA 检测是最灵敏和最具指示性的血清学诊断方法。肺炎衣原体 肺炎衣原体极易造成呼吸系统感染，特别是支气管炎和肺炎。在老年人中发病 率较高，它所引起的肺炎占所有

3、肺炎病例的 10%。微量免疫荧光法（ MIF ）是最灵敏 和最特异的诊断方法。腺病毒腺病毒是一种重要的呼吸道病原体，能引起上呼吸道疾病，伴随有急骤发热和 轻度呼吸道感染。呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒 （ RSV）是两岁以下幼儿呼吸道感染的主要病原体，在冬季爆发 流行。流感病毒它是流感的病原体，在具有潜在病理学的患者中会产生严重的并发症。由于它 易于与其它呼吸道疾病混淆，所以在流行期临床诊断很困难。因此，实验室诊断就 显得非常重要。副流感病毒副流感病毒 1、2和 3型在 2-4岁儿童中能引起喉气管支气管炎 （哮吼）。3型具 有流行性， 1 和 2 型具有地域性。【检测原理】间接免疫荧光法（ IF

4、A ）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生 的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤 步骤中除去。在下一步骤中，抗原 -抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用 免疫荧光显微镜观察结果。【主要组成成份】除 PBS 外，所有试剂均可直接使用。为了易于识别，所有试剂均有一个给定的 编号。在操作骤中，写明了每一步所使用试剂的编号。1 载玻片： 10片（ 10 孔/片），含有下列抗原：1.嗜肺军团菌血清 1 型（悬浮于 0.5%正常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细 菌聚集）2.McCoy 细胞中的肺炎支原体3.Q 热立克次体 II 期（悬浮于 0.5%正

5、常鸡卵黄囊中以增强抗原吸附性和避免细菌 聚集）4.肺炎衣原体（原生小体）5.HEp-2 细胞中的腺病毒6.HEp-2 细胞中的呼吸道合胞病毒7.LLC-MK2 细胞中的甲型流感病毒8.LLC-MK2 细胞中的乙型流感病毒9.LLC-MK2 细胞中副流感病毒 1、2和 3型10.质控孔。 除了嗜肺军团菌， 载玻片中的所有抗原都是从细胞培养物中获得。 每一个病毒孔里都含有 1%15%用甲醛灭活的感染细胞，无感染的细胞用丙酮固定。2 PBS：1瓶， pH 7.2PBS粉末，用 1L 蒸馏水溶解。3阳性质控： 500 L 阳性质控血清，含叠氮钠。4阴性质控： 500 L 阴性质控血清，含叠氮钠。5M

6、FITC 标记的抗人 IgM 结合物：2 x 1.1mL，荧光素标记的抗人 IgM 磷酸缓冲液， 含有伊文斯蓝、叠氮钠和蛋白稳定剂。6 封闭介质 ： 3mL，甘油缓冲液，含叠氮钠。7 抗人 IgG 球蛋白（吸附剂）： 1 x 1.5mL（羊抗人 IgG ，含叠氮钠）。 需要但未提供的材料：1.精确的微量移液器2.恒温培养箱3.蒸馏水4.24x60 mm 盖玻片5.湿盒6.荧光显微镜以及制造商推荐的滤光片【储存要求及有效期】28储存。不要使用超出标签上有效期的试剂。未拆封的试剂盒 28储存可稳定至标示有效期的月末。拆封后试剂的储存试剂稳定性和储存溶解后的 PBS2-8oC 4 个月，在有效期内使

7、用其它组分参照包装标签的有效期 （ 2-8oC 储存）试剂的稳定性及操作 在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。仅使用试验所需量的吸附剂、 PBS、质控血清和结合物溶液， 剩余的试剂不要倒回瓶中。 PBS溶解后储存在 28 oC，如出现 浑浊请勿使用。对于试剂盒内试剂的不正确操作， VIRCELL, S.L. 将不对其试验结果负责。 【适用仪器】荧光显微镜【注意事项】1.仅用于体外诊断。仅限专业人员使用。2.仅使用试剂盒内的组分，不要混用不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。只有 PBS、吸附剂、封闭介质和载玻片可与其他批次 VIRCELL IFA 试剂盒通用，其它组分同批 次可以混用。3.每步操作必

8、须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。4.包装如有损坏请勿使用。5.切勿用嘴吸移液管加样。6.本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人 源性物质。尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为 HBsAg、HCV 抗体和 HIV 抗 体阴性， 质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。 孔内包被的经灭活*实验前准备只有 PBS需要预先配制。将试剂 2 中的成分加入 1L 蒸馏水中，摇匀直止完全 溶解。配好后储存在 2-8oC。的嗜肺军团菌血清 1 型、肺炎支原体、 Q 热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道 合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒

9、和副流感病毒 1、2和 3型，也仍应视为具 有潜在感染性并小心处置。 目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存在， 因 此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置， 应遵守当地关于临床废弃物处理的法 规。7.结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度 0.1%），避免接触酸和重金属。8.封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。9.伊文斯蓝（浓度 0.1%）是一种致癌物。请勿接触皮肤和眼睛。万一接触到该溶 液，用水彻底冲洗并到医院检查。10.仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。11.载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。12.显微镜

10、光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。13.不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。14.每个载玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用没有用过的孔。15.试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。16.吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。【样本要求】 需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整 性。血清样本采集后 28 oC 冷藏，如 7 天内不检测，则应冷冻（ -20oC）保存。不要 反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是 IgM 。不要使用高血脂或污染的血清。 若样本中含有微粒要离心使之澄清。【检测方法】*实验步骤1.使用前，将所有试剂平

11、衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。2.按 1: 1比例稀释血清标本，即 25L 血清加入 25L PBS2 中。质控血清 3 4不需 要稀释。3.用抗人 IgG 吸附剂 7 处理稀释后的血清：将 30L 稀释后的血清加入 150L 吸附 剂中，彻底混匀。质控血清 3 和 4 不需吸附剂处理。处理后的血清要离心除去沉淀， 以防干扰检测。4.在载玻片 1 的每孔中加 15L 吸附剂处理过的血清。在一个载玻片的每孔中加入 15L不稀释的阳性质控 3，在另一个载玻片的每孔中加入 15L 不稀释的阴性质控 4。5.将载玻片放入湿盒中， 37温育 90 分钟。6.用 PBS 2 的缓慢水流简单冲洗载玻片

12、 1（避免 PBS直接冲入孔内）后，浸泡在 PBS 中并放置在振荡器上轻轻摇动 10 分钟。将载玻片在蒸馏水中简单蘸洗。7.载玻片 1 自然风干。8.每孔加入 15L 抗人 IgM FITC 结合物溶液 5M （不需稀释）。9.将载玻片放入湿盒， 37温育 30 分钟。10.重复 6 和 7 的洗涤步骤。11.每孔加 1 小滴封闭介质 6，小心盖上盖玻片。12.尽快用荧光显微镜在 400 倍放大率下观察结果。如果不能立即观察， 可将其避光 放置于 2-8oC 不超过 24 小时。【内部质量控制】 每一批产品在放行前都要经过更加严格的内部质量控制（ Q.C.）的检验。质控材 料可溯源到经过内部确

13、认的参考血清盘。【有效性判断】 每一次试验都应设立阳性和阴性质控，以确认试验和试剂盒的有效性。 观察到的荧光模式应为： 阳性质控：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的 1-15% 细胞出现苹果绿细胞核和胞浆或胞膜荧光 （在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时 观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光； 支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性质控：军团菌、肺炎衣原体和立克次体没有荧光，支原体、腺病毒、甲型和 乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。检测结果的解释】阳性结果： 可以观察到腺病毒、 流感病毒、 呼吸道合胞病毒

14、或副流感病毒对阳性 血清的 1-15%细胞的细胞核和胞浆出现苹果绿色荧光 (在副流感病毒和呼吸道合胞病 毒中能同时观察到着色的合胞) ；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹 果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性结果：可观察到军团菌、 肺炎衣原体和立克次体没有荧光， 支原体、腺病毒、 甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。如果所有细胞或第 10 孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体，不能判为阳性， 应用其他方法进行检测。当质控孔中无荧光时一定要查明原因。由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，阳性结果需结合临床症状综合 评价。建议做较高稀释

15、度的检测来提高阳性预测值。呼吸道感染 IgG联检试剂( PNEUMOSLIDE IgG )更适合于筛查试验。对于广泛 流行的疾病，可能会在一个标本中出现几个阳性结果。呼吸道感染 IgM 联检试剂 (PNEUMOSLIDE IgM )由于其高度特异性，是一种非常适用的技术，因为 IgM 阳 性不会超过 3 个月，但对重复感染灵敏度较低。近期感染诊断的理想方法是同时使 用呼吸道感染 IgG联检试剂和呼吸道感染 IgM 联检试剂： IgM 联检试剂适用于检测 成人的第一个标本和儿童的第一、 第二个标本， IgG 联检试剂适用于检测成人的第二 个标本。与说明书中所列结果不同不能判为阳性。在初次感染和再

16、次感染的过程中， IgG 和 IgM 抗体有不同的表现方式： 初次感染 时，几乎在所有的情况下 IgM 和 IgG 均出现(IgM 早于 IgG 出现)；而再次感染时， 在所有的情况下均不出现 IgM ，因此 IgG 的检测是唯一有用的诊断方法。在许多疾 病中病人的一生都可能存在高滴度的 IgG，而 IgM 一般情况下仅在感染后 23 个月 存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。【检验方法的局限性】1.本试剂盒用于检测人血清。2.建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结 果。特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、 温育的时间控制对获得准确结果 都是很重

17、要的。3.样本的检测结果应与临床评价以及其他诊断方法结合使用。4.本检测不能指出感染部位，不能单独使用。5.抗体水平无显著上升时不能排除感染的可能性。6.在感染早期采集的样本可能是检测不到 IgG 的，在这种情况下建议采用 IgM 检测， 或者在 14-21 天后采集第二个血清样本， 并与原标本同时检测来确定是否发生血清转 换。7.婴儿的 IgG 检测结果要作谨慎解释， 因为出生前母体的 IgG 被动的传递给了胎儿。 对 6 个月以下的婴儿 IgM 检测是更为有用感染标志物。8.单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集成对样本（急性期 和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的

18、明显升高。9.对患有自身免疫性疾病病人的血清， 用 IFA 检测时，支原体、 腺病毒、流感病毒、 呼吸道合胞病毒和副流感病毒， 会在细胞上发生非特异性反应， 这些血清不能用本方 法评价。质控孔用于检测这种现象。在嗜肺军团菌和 Q 热立克次体中，有时血清会 含有与卵抗原反应的抗体， 所以使用卵黄囊固定抗原会出现非特异性荧光。 当出现这 种情况时，该血清就不能用 IFA 进行分析了。10.未对本检测在疗效随访方面的性能做过评估。11.除了肺炎外，未对本技术在肺炎衣原体引起的其他疾病方面的性能作过评估。 【产品性能指标】1.灵敏度和特异性嗜肺军团菌血清 1 型与另一个商品化的 IFA 试剂盒对照检测

19、 82 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM8294.4%98.4%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。肺炎支原体与一种 ELISA 试剂盒对照检测 62 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM6296.8%100.0%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。Q 热立克次体与另一个商品化的 IFA 试剂盒对照检测 74 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM74100.0%97.6%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。肺炎衣原体与另一个商品化的 IFA 试剂盒对照检测 61 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM61100.0%980%有非特异性反应的

20、的血清从最终计算中删除。腺病毒与一种 ELISA 试剂盒对照检测 74 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM7485.7%97.0%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 呼吸道合胞病毒与一种 ELISA 试剂盒对照检测 97 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM9793.8%100.0%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。甲型流感病毒与一种 ELISA 试剂盒对照检测 46 份血清样本，结果如下：样本数灵敏度特异性IgM4694.1%96.4%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。乙型流感病毒与一种 ELISA 试剂盒对照检测 40 份血清样本，结果如下：样本数灵

21、敏度特异性IgM40100.0%96.4%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。 副流感病毒 1、2 和 3型与一种 ELISA 试剂盒对照检测 36 份血清样本。结果如下：样本数灵敏度特异性IgM36100.0%96.3%有非特异性反应的的血清从最终计算中删除。2.精密度 分析内精密度：在相同实验条件下由同一个操作人员在同一次试验中对 3份血清（ 2 份阳性和 1 份阴性）分别进行 5 组加样检测。结果：滴度变化不超过一个稀释度。分析间精密度：在 5 种不同条件下（不同操作人员或不同试验日期）对 3 份血清（ 2 份阳性和 1 份阴性）进行检测。结果：滴度变化不超过一个稀释度。3.交叉反应

22、和干扰 嗜肺军团菌血清 1 型检测 20份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和 Q 热立克次体）、革兰 氏阴性细菌（布鲁氏菌，沙门氏菌）和抗核抗体阳性血清样本。肺炎支原体检测 12份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、肺炎衣原体和 Q 热立克次体）阳性血 清样本。Q 热立克次体检测 20 份细菌综合病症组（肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌）、同种属 的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。肺炎衣原体检测 20份细菌综合病症组（嗜肺军团菌、 Q 热立克次体和肺炎支原体），同种 属的细菌（发疹伤寒等的病原体）和抗核抗体阳性血清样本。腺病毒检测 8 份病毒综合病症组（ RSV、甲型和乙型流

23、感病毒和副流感病毒）阳性血清 样本。呼吸道合胞病毒检测 10 份病毒综合病症组（腺病毒、甲型和乙型流感病毒和副流感病毒）或根 据病毒分类（麻疹）阳性血清样本。甲型流感病毒检测 8 份病毒综合病症组（ RSV、乙型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性的 血清样本。乙型流感病毒检测 8 份病毒综合病症组（ RSV、甲型流感病毒、腺病毒和副流感病毒）阳性血 清样本。副流感病毒血清 1、2和 3型检测 8份病毒综合病症组 （RSV、甲型和乙型流感病毒和腺病毒） 阳性血清样本。 结论检测结果表明本试剂盒与上述参考品无交叉反应或干扰， 从而证实了该试剂盒的 特异性反应。其它干扰研究对 25 份类风湿因子阳性

24、血清进行了 2 种病毒和 2 种细菌抗原 IgG 和 IgM 抗体 的检测。对另外两份血清进行了每种抗原 IgG 和 IgM 抗体的检测。在 IgM 检测中， 用抗 IgG 抗体对血清进行了吸附处理。 结果显示，吸附剂可以有效避免类风湿因子的 干扰。经验证，吸附剂也可以有效地避免 IgG 抗体过量造成的假阴性。 【标签符号】体外诊断用医疗器械使用有效期8oC2oC储存条件 2-8oCx可用于检测的次数（规格）批号目录号使用说明书每个载玻片上反应孔的数量简明操作程序】参考文献】1.Berdal, B. P.; Fields, P. I., and Melbye, H. Chlamydia pne

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