如何理解测序蜂图解读.docx
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如何理解测序蜂图解读
测序峰图
测序方法
现代DNA序列测序可分为一二三代。
一代测序
第一代测序技术包括链终止法和化学降解法，其主要特点是以待测DNA为模板，根据碱基互补规则采用DNA聚合酶体外合成新链。
由于新链中渗入了带有标记的碱基类似物，可用于制备末端带有标记的DNA单链。
这些末端带有标记的DNA单链是一个群体，在凝胶电泳时可以形成彼此仅差一个碱基的梯形条带。
根据末端碱基的特有标记可以读取待测DNA的序列组成。
链终止法（Sanger法）
反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：
1.待测的DNA单链片段，作为模板；
2.DNA聚合酶；
3.序列已知且与模板3'端互补的引物；
4.四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP）；
5.四种双脱氧核苷酸中的一种，作为DNA链合成的末端终止剂。
在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链3’端的-OH连接，而2’,3’-双脱氧核苷三磷酸核糖基的2’,3’位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性：
1.dNTP掺入新生链，使链继续延伸。
2.2’,3’-ddNTP掺入，使新生链的合成终止。
由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的DNA片段。
最后通过A、T、G和C四组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。
要求测序时使用的DNA聚合酶不能有5’-3’外切酶活性（可将新合成DNA链的5’-末端除去核苷酸而改变链的长度）、3’-5’外切酶活性（可将错配的碱基除去，再补上正确配对的核苷酸）。
这两种活性会产生干扰条带。
荧光染料标记物在Sanger法中的应用
目前已发现具有不同荧光色彩的标记化合物，可将其分别与指定的ddNTP结合，如ddATP标记绿色荧光，ddCTP蓝色荧光，ddTTP红色荧光，ddGTP黑色荧光。
这四种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合链终止反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T和G的DNA单链。
毛细管电泳
带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其分配系数不同进行高效、快速分离的电泳技术。
测序峰图
峰图是以4种颜色连续的峰型图代表A、T、G、C4种碱基序列的图。
峰的高低说明了信号的强弱，宽窄表示的是分离效果，可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄。
重叠则说明了样品中有长度相同但是序列不同的片段。
概念：
读长：
序列读取的碱基长度，峰图上方横向显示的数字。
信号：
测序序列是通过对不同碱基所携带的不同颜色的荧光信号翻译所得，荧光信号的强弱是我们常说的信号。
成功峰图？
峰型：
尖锐、对称、无底峰；
读长：
800bp可信；
信号：
正常（1k~20k），走势平缓下降。
测序峰图中可能存在的问题
峰型问题
可信读长问题
信号问题
双峰
非单克隆
特征：
从插入位点开始双峰或某个位置开始双峰。
处理方法：
重新挑单克隆测序。
杂合（突变）
特征：
峰图中某些位置双峰。
Figure1SNP
Figure2杂合
缺失
特征：
从碱基缺失位置出现移码。
移码-----底峰序列表现为主峰向左或向右移动后的序列。
引物问题（YM）：
引物合成不纯或降解
特征：
序列一开始就出现移码现象
处理方法：
重新合成引物再测序
结合问题（JH）
特征：
（1）一开始就是双峰，在某一点终止或从头到尾双峰
可能原因：
模板上有2个或2个以上以上引物结合位点、模板或引物不纯。
处理方法：
重新制备样品或设计特异引物测序
夹峰：
模板量高
特征：
峰图中两峰之间夹有小杂峰，一般不影响主峰的读取，在信号图中表现为反应信号过高。
处理方法：
直接或稀释重跑，降低模板量测序
宽峰
可能原因：
模板不纯或POP7胶中有气泡
处理方法：
重跑
底峰不干净
特征：
信号图中基线不齐或信号弱
可能原因：
模板纯度不好，有杂质；模板量偏低或反应进行不充分
处理办法：
重新纯化或重送样；加量重做或重送样
引物峰及引物二聚体峰
特征：
在20-30、40-60bp碱基处有高信号的峰形成，之后信号可能衰减。
处理方法：
重新合成引物或重新设计引物测序。
引物形成二聚体致使反应无信号
干扰峰（染料峰）和酒精峰
特征：
4个干扰峰固定出现在30、40、70、110bp附近。
处理方法：
重新测序
降解峰
特征：
在220、450bp附近G碱基降解，峰型扩散。
处理方法：
若不影响碱基判读不安排调整，否则安排重新测序。
重复序列（CF）
特征：
单碱基或两个以上碱基重复出现，导致后续峰图可能移码或乱峰。
处理方法：
因重复未测到的序列，建议加测反向补拼。
高GC（GC）
特征：
序列局部碱基GC富集，之后可能信号衰减，峰图变乱。
回文结构及其他结构（JG）
特征：
信号衰减或中断，峰图变乱。
处理方法：
最好选用GC优化程序。
无信号
特征：
峰图表现为杂乱无章。
形成原因：
引物和模板不能正常结合反应，包括漏加，加错，有影响结合或影响反应因素。
处理方法：
菌液用通用引物测无信号的安排重新摇菌、自带引物无信号建议通用引物测序；质粒、pcr测序无信号的不调整，建议客户重新送样，若失败较多的挑几个重测，并跟客户说明情况
在进行DNA测序时，紧接引物的10~30碱基有时不一定能完全读清楚。
读书的好处
1、行万里路，读万卷书。
2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。
3、读书破万卷，下笔如有神。
4、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。
——达尔文
5、少壮不努力，老大徒悲伤。
6、黑发不知勤学早，白首方悔读书迟。
——颜真卿
7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自苦寒来。
8、读书要三到：
心到、眼到、口到
9、玉不琢、不成器，人不学、不知义。
10、一日无书，百事荒废。
——陈寿
11、书是人类进步的阶梯。
12、一日不读口生，一日不写手生。
13、我扑在书上，就像饥饿的人扑在面包上。
——高尔基
14、书到用时方恨少、事非经过不知难。
——陆游
15、读一本好书，就如同和一个高尚的人在交谈——歌德
16、读一切好书，就是和许多高尚的人谈话。
——笛卡儿
17、学习永远不晚。
——高尔基
18、少而好学，如日出之阳；壮而好学，如日中之光；志而好学，如炳烛之光。
——刘向
19、学而不思则惘，思而不学则殆。
——孔子
20、读书给人以快乐、给人以光彩、给人以才干。
——培根
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