乳酸脱氢酶LDH比色法测试盒.docx
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乳酸脱氢酶LDH比色法测试盒
FocusonyourresearchServiceforlifescience
乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）比色法测试盒
货号：
Ｅ－ＢＣ－Ｋ０４６－Ｍ方仪器：
酶标仪（４４０－４６０ｎｍ）规格：
９６Ｔ（４０ｓ
FocusonyourresearchServiceforlifescience
基本信息
用途本试剂盒合用于检测血清、血浆、胸水、组织、细胞等样本中LDH活力。
检测范围及敏捷度检测范围：
6-1000U/L敏捷度：
6U/L背景介绍乳酸脱氢酶（EC，LDH）是一种氧化复原酶，它催化丙酮酸和乳酸的互相转变，同时将NADH氧化成NAD+[1]。
LDH是一种四聚体分子，由两个亚基构成，分别为H亚基和M亚基[2]。
在组织损害或红细胞溶血后，细胞将LDH开释到血液中。
细胞外的LDH活性用于检测细胞损害或细胞死亡[3]。
检测原理以辅酶I为递氢体，LDH催化乳酸产生丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比，经过测定OD值，可计算LDH的活力。
本试剂盒测组织和细胞样本时，需测定总蛋白浓度，介绍使用BCA法（货号：
E-BC-K318-M）。
供给试剂和物件
编号
名称
规格（size）
保留方式
（96T）
（Storage）
试剂一
基质液
5mL×1瓶
2-8℃保留6个月
（Reagent1）
（SubstrateBuffer）
试剂二
辅酶I
粉剂×1支
2-8℃保留6个月
（Reagent2）
（CoenzymeI）
试剂三
显色剂
5mL×1瓶
2-8℃避光保留6
（Reagent3）
（ChromogenicAgent）
个月
试剂四
碱溶液
5mL×1瓶
2-8℃保留6个月
（Reagent4）
（AlkaliReagent）
试剂五
2μmol/mL丙酮酸标准品
1mL×1支
2-8℃保留6个月
（Reagent5）
（2μmol/mLPyruvicAcidStandard）
96孔酶标板
1板
96孔覆膜
2张
样本地点标志表
1张
注：
试剂严格按上表中的保留条件保留，不一样试剂盒中的试剂不可以混用。
所需自备物件仪器：
酶标仪（440-460nm）、37℃恒温箱、微量移液器（1000μL，200μL，100μL，10μL）、多道移液器（300μL）。
耗材：
枪头（1000μL，200μL，10μ）L。
试剂：
双蒸水、生理盐水（0.9%NaCl）或PBS（M，pH）。
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安全提示配制试剂以前，请穿着好防备装备。
试剂盒中部分试剂含有危险性物质。
严禁食入，吸入，直接接触眼睛、皮肤和衣物。
使用完后的试剂瓶经完全冲洗后再办理。
实验准备
实验重点点①加试剂二应用液时，将枪头伸入反响液中频频吸打几次，并注意更换枪头。
②加入试剂四后，用多道移液器进行混匀。
③加样时要尽量防止产生气泡。
如有气泡，用枪头破裂后再进行测定。
试剂准备①试剂盒中试剂均衡至室温（试剂二除外）。
②试剂二应用液的配制：
取试剂二置于冰盒上，一支粉剂加１．３３双ｍ蒸Ｌ水溶解，混匀，２－８℃１可５天保。
存如需多次检测，可分装后－２０℃保留１个月。
③试剂四应用液的配制：
按试剂四：
双蒸水为１：
的９体积比混匀即可，现用现配，２－８℃可保留７天。
样本准备
样本办理
详细操作请拜见附录
2。
样本的稀释
在正式检测前，需选择
2-3例预期差别大的样本稀释成不一样浓度进行
预实验，依据预实验的结果，联合本试剂盒的检测范围（
6-1000U/L），
请参照下表稀释：
LDH活力（U/L）
样本与稀释液的体积比
稀释倍数
<1000
不稀释
1
1000-10000
1:
9
10
注：
稀释液为双蒸水或生理盐水（0.9%NaCl）或PBS（M，pH）。
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操作过程
检测环境室内温度２５－３０℃，最正确检测波４长５０ｎｍ，最后反响３体２积５μＬ。
微量移液器的注意事项①移液器取试剂前，请用该试剂均衡枪头（迟缓吸液，频频吹打三次）。
②不可以将枪头外壁上的液体加入到反响系统。
酶标板设置
注：
A-H：
标准孔；S1-S40：
测定孔；S1'-S40'：
比较孔。
标曲浓度稀释表
编号
2μmol/mL标准品（μL）双蒸水（μL）标准品浓度（μmol/mL）
A
0
400
0
B
10
390
C
20
380
D
40
360
E
80
320
F
120
280
G
160
240
H
200
200
标准品浓度（μｍｏｌ／ｍＬ：
）加入到反响系统以前的标准品浓度。
操作步骤
①
标准孔：
取５μＬ双蒸水加入到标准孔中，再取
８个不一样浓度的标
准２品０各μＬ，分别加入对应的标准孔中；
测定孔：
２加０入μ待Ｌ测样本；
比较孔：
５加入μ双Ｌ蒸水、２０μＬ待测样本。
②
向步骤①中的各孔加入
２５μ试Ｌ剂一。
③
向步骤②中的测定孔加入５μ试Ｌ剂二应用液。
④
混匀，３７℃孵育１５
ｍｉｎ。
⑤
向步骤④中的各孔加入
２５μ试Ｌ剂三，混匀，３７℃孵育
１５
ｍｉｎ。
⑥向步骤⑤中的各孔加入
２５０μＬ试剂四应用液，混匀，室温静置
５
ｍｉｎ。
⑦
波长４５０ｎｍ，测Ｏ定Ｄ值。
FocusonyourresearchServiceforlifescience操作表
标准孔
测定孔
比较孔
双蒸水（μL）
5
--
5
不一样浓度标准品（μL）
20
--
--
待测样本（μL）
--
20
20
试剂一（μL）
25
25
25
试剂二应用液（μL）
--
5
--
混匀，37℃孵育15min。
试剂三（μL）
25
25
25
混匀，37℃孵育15min。
试剂四应用液（μL）
250
250
250
混匀，室温静置5min，波长450nm，测定OD值。
结果计算标准曲线：
y=ax+b血清、血浆、浇灌液、细胞培育液样本：
定义：
每升样本37℃与基质作用15min，在反响系统中产生1μmol丙酮酸为1个LDH活力单位（U）。
计算公式：
*
LDH活力（U/L）=（ΔA-b）÷a×f×1000
450动物组织、细胞样本：
定义：
每克组织蛋白37℃与基质作用15min，在反响系统中产生1μmol丙酮酸为1个LDH活力单位（U）。
计算公式：
*
LDH活力（U/gprot）=（ΔA450-b）÷a×÷fCpr×1000
注：
y：
标准品在
450nm波优点的绝对OD值
x：
标准品的浓度a：
标曲的斜率b：
标曲的截距ΔA450：
测定孔OD值-比较孔OD值f：
待测样本加入检测系统以前的稀释倍数Cpr：
待测样本的蛋白浓度（gprot/L）1000*：
1L=1000mL
FocusonyourresearchServiceforlifescience实例剖析比如检测人血清：
用PBS（M，pH）将人血清稀释10倍，取mL稀释后的人血清，按操作表操作，结果以下：
标准曲线：
y=x，测定孔均匀OD值为，比较孔均匀OD值为，计算结果为：
÷
×10
×1000
LDH活力（U/gprot）=--0.00789）
=U/gprot
依据说明书操作，测定人血清（稀释10倍，加样量20
μL）、猪血浆（稀
释50倍，加样量20μL）、大鼠肺组织（10%组织匀浆的蛋白含量
g/L，稀释500倍，加样量20μL）、HepG2细胞（蛋白含量g/L，稀释200倍，加样量20μL）中乳酸脱氢酶的活力（以下列图）。
参照文件
HolbrookJJ,LiljasA,SteindelSJ,etal.4LactateDehydrogenase[J].Enzymes,1975,11（8）:
191-292.MaekawaM.Lactatedehydrogenaseisoenzymes[J].JournalofChromatographyBBiomedicalSciences&Applications,1988,429（429）:
373-398.DrentM,CobbenNA,HendersonRF,etal.Usefulnessoflactatedehydrogenaseanditsisoenzymesasindicatorsoflungdamageorinflammation[J].EuropeanRespiratoryJournal,1996,9（8）:
1736-1742.
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附录１
重点数据
技术参数
检测范围
6-1000U/L
均匀批间差
2.4%
敏捷度
6U/L
均匀批内差
1.8%
均匀回收率
98%
批间差用三个不一样生产批号的试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中浓度样本和低浓度样本，每个批号每个浓度的样本重复检测3次（n=3），分别计算每个批号各浓度样本的均值，并按公式计算出各浓度样本的相对误差，最后得出均匀批间差2.4%批内差用一个试剂盒，检测在检测范围内的高浓度样本、中浓度样本和低浓
度样本，各个浓度的样本重复检测
6次（n=6），计算出均匀批内差1.8%
CV=
s
×100%
s---Standarddeviation
x
敏捷度依据试剂盒操作规程以丙酮酸做标准品测定标曲和20个空白的OD值。
绘制标准曲线，计算出空白OD值的标准差。
依据IUPAC公认的公式3倍的标准差除以标曲斜率计算出敏捷度mmol/L。
依据乳酸脱氢酶的定义，换算成LDH活力为6U/L回收率向样本中增添高、中、低三个浓度的丙酮酸标准品，每个浓度样本重复测3次（n=3），做回收率实验，得出均匀回收率98%标准曲线（数据仅供参照）用丙酮酸作为标准品，绘制标曲（以下列图）：
FocusonyourresearchServiceforlifescience用乳酸脱氢酶（ＳＩＧＭＡ，Ｌ２６２５－５０ＫＵ，６３５０Ｕ／ｍＬ）作为标准品标准品稀释：
将乳酸脱氢酶用PBS（M，pH）配制成5KU/mL，再用PBS（M，pH）稀释至以下的浓度：
浓度（KU/mL）
1
2
3
4
10KU/mL标准品（μL）
5
10
50
100
200
300
400
PBS（μL）
495
490
450
400
300
200
100
依据以下操作表进行操作，读取数据：
空白孔
标准孔
双蒸水（μL）
25
乳酸脱氢酶标准品（μL）
20
试剂一（μL）
25
25
试剂二应用液（μL）
5
混匀，37℃孵育15min。
试剂三（μL）
25
25
混匀，37℃孵育15min。
试剂四应用液（μL）
250
250
混匀，室温静置5min，波长
450nm，测定OD值。
读取数据（以下列图）：
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附录２样本制备
样本要求①在测试以前选择2-3个预期差别大的样本进行预实验。
②血清样本中不可以有溶血，由于红细胞内的LDH活力较血清内高约100倍。
样本中不可以含有SDS、Tween20、NP-40、TritonX-100等去污剂。
④不可以使用草酸盐抗凝。
（草酸盐会克制LDH活力）⑤参照稀释倍数见常有样本稀释倍数表。
以下样本办理方法仅供参照。
血清样本取新鲜血液，在25℃条件下静置30min使血液凝固。
4℃，2000×g离心15min，取上层淡黄色澄清液体即为血清。
血清置于冰上待测，若不可以当日检测，于-80℃保留，可储藏一个月。
血浆样本取新鲜血液加入到盛有抗凝剂的管中（肝素作为抗凝剂，肝素浓度为：
IU/mL血液），颠倒混匀，4℃，700-1000×g离心10min，取上层淡黄色透明液体即为血浆，不可以汲取中间白色扰乱层（白细胞和血小板）。
将血浆置于冰上待测，若不可以当日检测，于-80℃保留，可储藏一个月。
胸水样本取新鲜胸水加入到盛有抗凝剂的管中（肝素作为抗凝剂，肝素浓度为：
IU/mL胸水），颠倒混匀，4℃，10000×g离心10min，取上清于冰上待测，若不可以当日检测，于-80℃保留，可保留一个月。
１０％组织匀浆取g新鲜组织块，用2-8℃的PBS（M，pH）漂洗，去除血液，滤纸吸干，称重，放入匀浆容器中，依据重量（g）:
体积（mL）=1:
9的比率加入2-8℃的匀浆介质，进行匀浆，4℃，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，若不可以当日检测，于-80℃保留，可保留一个月。
细胞样本
悬浮细胞：
4℃，1000×g离心10min采集细胞，依据
106个细胞加入300-500μL匀
浆介质的比率加入匀浆介质，进行机械匀浆，充分破裂（无显然的细胞积淀，可在显微镜下察看），4℃，10000×g离心10min，取上清置于冰上待测，若不可以当日检测，于-80℃保留，可保留一个月。
贴壁细胞：
吸弃培育液，用PBS（M，pH）将细胞洗一遍。
用细胞刮刮下细胞（不可以用胰酶办理），加入2-5mLPBS（M，pH），采集细胞悬液，后办理方法见悬液细胞办理方法。
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注：
匀浆介质：
生理盐水（0.9%NaCl）或PBS（M，pH）。
匀浆方式：
a.手工匀浆b.机械匀浆c.超声破裂ａ．手工匀浆：
3将组织称重，剪碎呈1cm大小，倒入玻璃匀浆管中，加入匀浆介质，左手持匀浆管将下端置于冰浴中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8min），组织充分匀浆；或许倒入研钵中，加入液氮进行研磨，充分研磨后，加入匀浆介质，再将制好的匀浆汲取到EP管中备用。
ｂ．机械匀浆：
将已称重的组织装入EP管，加入匀浆介质，用组织匀浆机，在冰水浴条件下，60Hz，90s研磨制成组织匀浆，皮肤、肌肉组织及植物组织等可适合延伸匀浆时间。
ｃ．超声破裂：
在冰水浴条件下，用超声波发生器以振幅14μm超声办理60s，破裂细胞；或许用超声波破裂仪，200W，2s/次，空隙3s，总时间5min。
常有样本的稀释倍数表：
样本
稀释倍数
人血清
10倍稀释
人血浆
15-30倍稀释
猪血清
10-20倍稀释
人胸水
5-8倍稀释
10%小鼠肾组织匀浆
500-800倍稀释
10%小鼠肺组织匀浆
500倍稀释
10%小鼠肝组织匀浆
500-800倍稀释
HepG2细胞匀浆
100-300倍稀释
稀释液：
PBS（M，pH）
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附录３
问题答疑
问题
可能原由
建议解决方案
复孔差别大
未严格依据说明书操作
操作前仔细阅读操作步骤和注
意事项
样本和标准品显色
孵育时间很短
保证充分的孵育时间
很低
样本稀释倍数太大
选择适合稀释倍数，从头检测
样本测不出值
样本加样量较低
增添加样量
样本保留时间过长或许保留
取用新鲜样本，从头检测
不妥
读数数值低
用不适合波长检测
选择正确的检测波长
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