中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标.docx

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中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标

中华人民共和国国家标准生活饮用水标准检验方法微生物指标

Standard examination methods for drinking water一Microbioloical parameters

1、菌落总数

1.1平皿计数法1.1.1范围本标准规定了用平皿计数法测定生活饮用水及其水源水中的菌落总数本法适用于生活饮用水及其水源水中菌落总数的测定。

1.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

1.1.2.1菌落总数standard plate - count加cteria水样在营养琼脂上有氧条件下37℃ 培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数

1.1.3培养基与试剂1.1.3.1营养琼脂1.1.3.1.1成分：

A    蛋白陈10gB    牛肉膏3g

C    氯化钠5gD    琼脂10g——20gE    蒸馏水1000ml1.3.1.2制法：

将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7.4一7.6，分装于玻璃容器中（如用含杂质较多的琼脂时，应先过滤），经103.43 kPa （121℃，15lb）灭菌20 min，储存于冷暗处备用。

1.1.4仪器

1.1.4.1高压蒸汽灭菌器。

1.1.4.2干热灭菌箱。

1.1.4.3培养箱36℃ 士2℃ 。

1.1.4.4电炉。

1.1.4.5天平。

1.1.4.6冰箱。

1.1.4.7放大镜或菌落计数器。

1.1.4.8 pH计或精密pH试纸。

1.1.4.9灭菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管、采样瓶等1.1.5检验步骤1.1.5.1生活饮用水1.1.5.1.1门以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL充分混匀的水样，注人灭菌平皿中，倾注约15mL已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照1.1.5.1.2待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于36℃士1℃ 培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为水样1 ml中的菌落总数1.1.5.2水源水1.1.5.2.1以无菌操作方法吸取lml充分混匀的水样，注入盛有9ml、灭菌生理盐水的试管中，混匀成1 :

 10稀释液。

1.1.5.2.2吸取I :

 10的稀释液工ml注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管中，混匀成l ：

10稀释液。

按同法依次稀释成l :

 1000 , l :

 10000稀释液等备用。

如此递增稀释一次，必须更换一支1mL灭菌吸管。

1.1.5.2.3用灭菌吸管取未稀释的水样和2个——3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内以下操作同生活饮用水的检验步骤。

1.1.6菌落计数及报告方法    作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。

在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。

若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。

然后再求该稀释度的平均菌落数。

1.1.7不同稀释度的选择及报告方法1.1.7.1首先选择平均菌落数在30一300之间者进行计算，若只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则将该菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例1）1.1.7.2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30一300之间，则视二者之比值来决定，若其比值小于2应报告两者的平均数（如表1中实例2）若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（如表l中实例3）若等于2亦报告其中稀释度较小的菌落数（见表l中实例4）。

1.1.7.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例5 ）1.1.7.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应以按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表l中实例6）。

1.1.7.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30——300之间，则应以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中实例7）。

1.1.7.6若所有稀释度的平板上均无菌落生长，则以未检出报告之1.1.7.7如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2个平板1cm翌中的菌落数，除2求出每平方厘米内平均菌落数．乘以皿底面积63.6cm2，再乘其稀释倍数作报告。

1.1.7.8菌落计数的报告：

菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五人方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表I“报告方式”栏）   

 中华人民共和国国家标准   生活饮用水标准检验方法微生物指标

Standard examination methods for drinking water一Microbiolo只ical parameters   

  2、总大肠菌群

2.1多管发酵法2.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。

2.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准2.1.2.1总大肠菌群total coljforms总大肠菌群指一群在37℃ 培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌2.1.3培养基与试荆2.1.3.1门乳糖蛋白膝培养液2.1.3.1.1成分 A    蛋白陈                    10g B    牛肉膏                    3g C    乳糖                      5g D    氯化钠                    5g E    嗅甲酚紫乙醇溶液（16g/L）  1mL F    蒸馏水                    1000ml2.1.3.1.2制法将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa （115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用2.1.3.2二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液〔2.1.3.1），除蒸馏水外，其他成分量加倍。

2.1.3.3伊红美蓝培养基2.1.3.3.1成分 A  蛋白陈             10g

 B  乳糖               10g

 C  磷酸氢二钾         2g D  琼脂               20g一30g E  蒸馏水             l000ml F  伊红水溶液（20g/l） 20ml

 G  美蓝水溶液（5g/L）  13ml 2.1.3.3.2制法    将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa （115℃ ，10lb）高压灭菌20min。

临用时加热融化琼脂，冷至50℃ ～55℃ ，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。

2.1.3.4革兰氏染色液2.1.3.4.1结晶紫染色液A成分：

 a  结晶紫                 1g b  乙醇（95%，体积分数）  20mL c  草酸钱水溶液（10g/l）  80mLB制法：

将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。

注：

结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。

2.1.3.4.2革兰氏碘液A成分：

 a  碘               1g b  碘化钾           2g

 c  蒸馏水           300 mlB制法：

将碘和碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。

2.1.3.4.3脱色剂乙醇（95%，体积分数）。

2.1.3.4.4沙黄复染液A成分：

 a  沙黄                    0.25g b  乙醇（95沉，体积分数）  10ml c  蒸馏水                  90mLB制法：

将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水2.1.3.4.5染色法A将培养18h一24h的培养物涂片。

B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。

C滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约30s，水洗E滴加复染剂，复染1min，水洗，待干，镜检。

2.1.4仪器2.1.4.1培养箱：

36℃ 士1℃ 。

2.1.4.2冰箱：

0℃ ～4℃ 。

2.1.4.3天平2.1.4.4显微镜。

2.1.4.5平皿：

直径为9cm。

2.1.4.6试管2.1.4.7分度吸管：

1mL , 10mL。

2.1.4.8锥形瓶2.1.4.9小倒管。

2.1.4.10载玻片2.1.5检验步骤2.1.5.1乳糖发酵试验2.1.5.1.1取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白陈培养液中，取lml水样接种到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注入到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml（即0.1ml水样）注入到10ml单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管  对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10 mL水样双料培养基，每份接种10ml水样2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.0lmL甚至0.1 ,0.01 ,0.001 ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。

接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀释后，取1mL接种．每递增稀释一次，换用1支1 mL灭菌刻度吸管。

2.1.5.1.3将接种管置36℃ 士l℃ 培养箱内，培养24h士2h，如所有乳糖蛋白膝培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。

2.1.5.2分离培养   将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃ 土1℃ 培养箱内培养18h——24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验深紫黑色、具有金属光泽的菌落；紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；淡紫红色、中心较深的菌落2.1.5.3证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌，同时接种乳糖蛋白豚培养液，置36℃ 士1℃培养箱中培养24h士2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在2.1.6结果报告   根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN （ most Probable number，最可能数）检索表，报告每l00ml水样中的总大肠菌群最可能数（MPN）值。

乌管法结果见表2.15管法结果见表3稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。

如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。

表2     用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN ）

5个10ml管中阳性管数       最可能数（MPN）

 0                             < 2.2

1                             2.2

2                             5.1

3                             9.2

4                             16.0

5                             >16

2.2滤膜法2.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定2.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

2.2.2.1总大肠菌群滤膜法membrane rilter technique ror total coliforms总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45um的微孔滤膜过滤水样，将滤膜贴在添加乳糖的选择隆培养基上37℃培养24h，能形成特征性菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。

2.2.3培养基与试剂2.2.3.1品红亚硫酸钠培养基

2.2.3.1.1成分：

 A  蛋白膝  10g B  酵母浸膏  5g C牛肉膏   5g D  乳糖    10g

 E  琼脂   15g——20g F  磷酸氢二钾   3.5g G  无水亚硫酸钠 5g H  碱性品红乙醇溶液（50g/L） 20 mL I  蒸馏水   1000 mL 

2.2.3.1.2储备培养基的制备    先将琼脂加到500ml蒸馏水中，煮沸溶解，于另500ml一蒸馏水中加人磷酸氢二钾、蛋白陈、酵母浸膏和牛肉膏，加热溶解，倒人已溶解的琼脂，补足蒸馏水至1000mL，混匀后调pH为7.2一7.4，再加人乳糖，分装，68.95 kPa （115℃,10lb）高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。

   本培养基也可不加琼脂，制成液体培养基，使用时加2 mL一3 mL于灭菌吸收垫上．再将滤膜置于培养垫上培养2.2.3.1.3平皿培养基的配制   将上法制备的储备培养基加热融化，用灭菌吸管按比例吸取一定量的50g/l的碱陛品红乙醇溶液置于灭菌空试管中，再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一灭菌试管中，加灭菌水少许，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以灭菌。

   用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉色为止，将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加到已融化的储备培养基内，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基15 ml倾人已灭菌的空平皿内待冷却凝固后置冰箱内备用。

此种已制成的培养基于冰箱内保存不宜超过两周。

如培养基已由淡粉色变成深红色，则不能再用

2.2.3.2乳糖蛋白膝培养液同2.1.3.1。

2.2.4仪器

2.2.4.1滤器

2.2.4.2滤膜，孔径0.45um

2.2.4.3抽滤设备

2.2.4.4无齿镊子。

2.2.4.5其他仪器同多管发酵法2.1.42.2.5检验步骤2.2.5.1准备工作2.2.5.1.1滤膜灭菌：

将滤膜放人烧杯中，加人蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次巧m谊。

前两次煮沸后需更换水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。

2.2.5.1.2滤器灭菌：

用点燃的酒精棉球火焰灭菌。

也可用蒸汽灭菌器l03.43kPa （121℃，151b）高压灭菌20min。

2.2.5.2过滤水样   用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注人滤器中，打开滤器阀门，在一5.07*10（4）Pa（负0.5大气压）下抽滤。

2.2.5.3培养   水样滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分。

移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将平皿倒置，放入37℃ 恒温箱内培养24h士2h。

2.2.6结果观察与报告2.2.6.1挑取符合下列特征菌落进行革兰氏染色、镜检：

紫红色、具有金属光泽的菌落；深红色、不带或略带金属光泽的菌落；淡红色、中心色较深的菌落2.2.6.1.1凡革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，再接种乳糖蛋白脉培养液，于37℃ 培养24h，有产酸产气者，则判定为急大肠菌群阳性2.2.6.1.2按式

（1）计算滤膜上生长的总大肠菌群数，以每100ml水样中的总大肠菌群数（CFU／100ml）报告之

总大肠菌群菌落数（CFU／100ml）=数出的总大肠菌群数*100/过滤的水样体积（ml）   

   2.3酶底物法2.3.1范围本标准规定了用酶底物法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的检测。

本法可在24h判断水样中是否含有总大肠菌群及含有的总大肠菌群的最可能数（MPN）。

本法可同时检测大肠埃希氏菌，见大肠埃希氏菌检测（4.3）。

2.3.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

2.3.2.1  总大肠菌群酶底物法enzym :

 sub , trate technique for total coliforms  总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生价半乳糖昔酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法

2.3.3培养基与试荆2.3.3.1培养基 在本标准中酶底物法采用固定底物技术，本方法采用（ MMO一MUG）培养基，可选用市售商品化制品。

每1000mlMMO一MUG培养基所含基本成分为：

 A硫酸铵                                5.0g B硫酸锰                                0.5 rng C硫酸锌                                0.5 mg D硫酸镁                                100 mg E氯化钠                                10g F氯化钙                                50mg G亚硫酸钠                              40mg H两性霉素B                             1mg 1邻硝基苯件-β-D-毗喃半乳糖普（ONPG ）     500mg J4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸普（MUG ）    75mg K茄属植物萃取物（solanium萃取物）       500mg L N-2-乙基呱嗓NZ乙磺酸钠盐（HEPES钠盐） 5.3g M N-2-乙纂呱嗦NZ乙磺酸（HEPEs ）            6.9g 2.3.3.2生理盐水    8.5g/l的生理盐水，用于稀释样品成分：

氯化钠    8.5g蒸馏水加至1000mL   溶解后．分装到稀释瓶内，每瓶90mL , 103.43kPa （ 121℃, 15lb） 20min高压灭菌

2.3.4仪器设备2.3.4.1量筒：

100ml、500ml、l000ml。

2.3.4.2吸管：

lml、5ml及10ml的无菌玻璃吸管或塑料一次性吸管2.3.4.3稀释瓶：

100ml、250ml、500mL及1O00ml能耐高压的灭菌玻璃瓶2.3.4.4试管：

可高压灭菌的玻璃或塑料试管，大小约15mm*10cm。

2.3.4.5培养箱：

36℃ 士1℃ 。

2.3.4.6高压蒸汽灭菌器。

2.3.4.7于热灭菌器（烤箱）。

2.3.4.8定量盘：

定量培养用无菌塑料盘，含51个孔穴，每一孔穴可容纳2ml水样。

2.3.4.9程控定量封口机：

用于51孔或97孔法（MPN法，最可能数法）定量盘的封口。

2.3.5检验步骤2.3.5.1水样稀释    检测所需水样为100mL若水样污染严重，可对水样进行稀释。

取10mL水样加人到90ml灭菌生理盐水中，必要时可加大稀释度。

2.3.5.2定性反应  用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加入2.7g士0.5gMMO—MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解后，放人36℃士1℃ 的培养箱内培养24h。

2.3.5.3 10管法2.3.5.3.1用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加人2.79士0.5gMMO—MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解2.3.5.3.2准备10支15mm*10cm或适当大小的灭菌试管，用无菌吸管分别从前述稀释瓶中吸取10ml水样至各试管中，放人36℃ 士1℃ 的培养箱中培养24h。

2.3.5.4  51孔定量盘法2.3.5.4.1用100ml的无菌稀释瓶量取100mL水样，加人2.7g士0.5gMMO一MUG培养基粉末，混摇均匀使之完全溶解。

2.3.5.4.2将前述100 ml水样全部倒人51孔无菌定量盘内，以手抚平定量盘背面以赶除孔穴内气泡，然后用程控定量封口机封口。

放入36℃士1℃ 的培养箱中培养24h。

2.3.6结果报告2.3.6.1结果判读   将水样培养24h后进行结果判读，如果结果为可疑阳性，可延长培养时间到28h进行结果判读，超过28h之后出现的颜色反应不作为阳性结果。

2.3.6.2定性反应   水样经24h培养之后如果颜色变成黄色，判断为阳性反应，表示水中含有总大肠菌群。

水样颜色未发生变化，判断为阴性反应定性反应结果以总大肠菌群检出或未检出报告2.3.6.3   10管法2.3.6.3.1将培养24h之后的试管取出观察，如果试管内水样变成黄色则表示该试管含有总大肠菌群。

2.3.6.3.2计算有黄色反应的试管数，对照表4查出其代表的总大肠菌群最可能数（MPN）。

结果以MPN/100 mL表示。

如所有管未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。

2.3.6.4  51孔定量盘法2.3.6.4.1将培养24h之后的定量盘取出观察，如果孔穴内的水样变成黄色则表示该孔穴中含有总大肠菌群。

2.3.6.4.2计算有黄色反应的孔穴数，对照表5查出其代表的总大肠菌群最可能数（MPN）。

结果以ml表示。

如所有孔未产生黄色，则可报告为总大肠菌群未检出。

3.1多管发酵法3.1.1范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的耐热大肠菌群。

本法适用于生活饮用水及其水源水中耐热大肠菌群的测定。

3.1.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1.2.1耐热大肠菌群thermotolerant coliform bacteria用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃ 仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。

3.1.3培养基与试剂3.1.3.1 EC培养墓3.1.3.1.11成分：

 A  胰蛋白脉            20g B  乳糖                5g C  3号胆盐或提合胆盐〕 1.5g D  磷酸氢二钾          4g

 E  磷酸二氢钾       1.5g F  氯化钠           5g G  蒸馏水           1000mL3.1.3.1.2制法：

将上述成分溶解于蒸馏水中，分装到带有倒管的试管中，68.95 kPa （l15℃，10lb）高压灭菌20min，最终pH为6.9士0.23.1.3.2伊红美蓝琼脂同2.1.3.33.1.4仪器3.1.4.1恒温水浴：

44.5℃ 士0.5℃ 或隔水式恒温培养箱。

3.1.4.2其他同总大肠菌群多管发酵法（2.1.4.1——2.1.4.9 ）3.1.5检验步骤3.1.5.1自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中．置44.5℃ 水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h士2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转种于伊红美蓝琼脂平板上，置44.5℃ 培养18h—24h，凡平板L有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性3.1.5.2如检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群2.1.5工接种乳糖蛋白陈培养液在44.5℃ 士0.5℃ 水浴中培养，以下步骤同3.1.5.1。

3.1.6结果报告根据证实为耐热大肠菌群的阳性管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每100 mL水样中耐热大肠菌群的最可能数（MPN）值。

3.2滤膜法3.2.1范围本标准规定了用滤膜法测定生活饮用水及低浊度水源水中的耐热大肠菌群本法适用于生活饮用水及低浊度水源水中耐热大肠菌群的测定3.2.2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。

3.2.2.1  耐热大肠菌群滤膜法mcm