食品微生物检测方法.docx
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食品微生物检测方法
食品微生物检测方法
范围
本标准规定了食品微生物检测方法
1菌落总数
1.1培养基和试剂
⑴、营养琼脂培养基:
按GB/T4789.28-2003中4.7规定
成分:
蛋白胨10克、牛肉膏3克、氯化钠5克、琼脂15~20克、蒸馏水1000ml
制法:
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中,加入15%氢氧化钠溶液2ml校正PH至7.2-7.4.加入琼脂,加热煮沸,使用权琼脂溶化.分装烧讧,121℃高压灭菌15分钟.
注:
此培养基可供一般细菌培养之用,注平板或制成斜面.如用于菌落计数,琼脂量为1.5%;如作成平板或斜面,则应为2%.
⑵磷酸盐缓冲液:
按GB/T4789.28-2003中3.22规定.
成分:
磷酸二氢钾34克、1mol/l氢氧化钠溶液175ml、蒸馏水825ml、PH7.2
制法:
先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000ml.
稀释液:
取储存液1.25ml,用蒸馏水稀释至1000ml,或每管10ml,121℃高压灭菌15分钟.
⑶明胶磷酸盐缓冲液
成分:
明胶2克、磷酸氢二钠4克、蒸馏水1000ml、PH6.2
制法:
加热溶解,校正PH,121℃高压灭菌15分钟.
⑷0.85%灭菌生理盐水
⑸75%乙醇
1.2设备和材料
⑴冰箱:
0~4℃
⑵恒温培养箱36℃±1℃
⑶恒温水浴锅46±1℃
⑷均质器或灭菌乳钵
⑸架盘药物天平:
0~500克,精确至0.5克.
⑹菌落计数器.
⑺大镜4×
⑻灭菌吸管:
1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)
⑼灭菌锥形瓶:
500ml
⑽灭菌玻璃珠:
直径约5mm
⑾灭菌培养皿直径约90mm
⑿灭菌试管16mm×160mm
⒀灭菌刀、剪子、镊子等。
1.3检验程序(菌落总数的检验程序见图1)
1.4操作步骤
⑴检样稀释及培养
a.以无菌操作将检样25克(ml)剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后,最好置均质器中以8000r/min~10000r/min的速度处理1min,做成1:
10的均匀稀释液。
b.用1ml的灭菌吸管吸取1:
10的稀释液1ml,沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管不要触及管内稀释液),振摇试管,混合均匀,做成1:
100的稀释液。
c.另取1ml灭菌吸管,按上条操作方法,做10倍递增稀释,如此每递增稀释一次,即换用1支1ml吸管。
d.根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计,,选择2~3个适宜稀释度,分别在做10倍递增稀释的同时,即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌培养皿内,每个稀释度做两个培养皿。
e.吸稀释液移入培养皿后,应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置46±1℃水浴锅保温)注入培养皿约15ml并转动培养皿使混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液灭菌培养皿内作空白对照。
f.待琼脂凝固后,翻转平板,置36±1℃温箱内培养48h±2h.
⑵菌落计数方法
做平板菌落计数时,可用肉眼观查,必要时用放大镜检查,以防遗漏。
在记下各平板的菌数后,求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
⑶菌落计数的报告
a.平板菌落数的选择
选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个平板,应采用两个平板平均数,其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数,若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。
平板内如有链状菌落生长时(菌落间无明显界线),若仅有一条链。
可视为一个菌落;如果有不同来源的几条链,则应将每条链作为一个菌落计。
b.稀释度的选择
1.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乖以稀释倍数报告之(见表1中例1)。
2.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视两者之比如何来决定。
若其比值小于或等于2,应报告其平均数,若大于2,则报告其中较小的数字,(见表1中例2及例3)。
3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300,则应按稀释度最高的平均菌落数乘以箕释倍数报告之(见表1中例4)。
4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释找最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例5)。
5.若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(见表1中例6)。
6.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,其中一部分大于300或小于30时,则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1中例7)。
c.菌落数的报告
菌落数在100以内时,按其实有数报告,大于100时,采用两位有效数字,在两位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算。
为了缩短数字后在的零数,也可用10的指数来表示(见表1)。
表1稀释度选择及菌落数报告方式
例次
稀释液及菌落数
两稀释液之比
菌落总数
(cfu/g)
报告方式(cfu/g(ml))
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
-
16400
16000
2
多不可计
295
46
1.6
37750
38000
3
多不可计
271
60
2.2
27100
27000
4
多不可计
多不可计
313
-
313000
310000
5
27
11
5
-
270
270
6
0
0
0
-
<1×10
<10
7
多不可计
305
12
-
30500
31000
2大肠菌群的检测
2.1大肠菌群的测定
2.1.1 设备和材料
⑴ 恒温培养箱:
36±1℃。
⑵ 冰箱:
0~4℃。
⑶ 恒温水浴锅:
44.5±0.5℃。
⑷ 架盘药物天平:
0~500g,精确至0.5g。
⑸ 显微镜10×~100×。
⑹ 均质器或乳钵。
⑺ 平皿:
直径为90mm。
⑻ 试管16mm×160mm。
⑼ 吸管1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。
⑽ 广口瓶或三角烧瓶:
容量为500mL。
⑾ 玻璃珠:
直径约5mm。
⑿ 载玻片。
⒀ 酒精灯。
⒁ 试管架。
⒂灭菌刀、剪子、镊子
2.1.2培养基和试剂
⑴乳糖胆盐发酵管:
成分:
蛋白胨:
20g
猪胆盐(或牛、羊胆盐):
5g
乳糖:
10g
0.04%溴甲酚紫水溶液:
25ml
蒸馏水:
1000ml
PH:
7.4
制法:
将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水,校正PH,加入指示剂,分装每管10ml,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min.
注:
双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。
⑵伊红美蓝琼脂平板
成分:
蛋白胨:
10g
乳糖:
10g
磷酸氢二钾:
2g
琼脂:
17g
2%伊红Y溶液:
20ml
0.65%美蓝溶液:
10ml
蒸馏水:
1000ml
PH:
7.1
制法:
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正ph,分装于烧瓶内,121℃高压灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并加热溶化琼脂,冷却至50~55℃,加入伊红和闰蓝溶液,摇匀,倾注平板。
⑶乳糖发酵管
成分:
蛋白胨:
20g
乳糖:
10g
0.04%溴甲酚紫水溶液:
25ml
蒸馏水:
1000ml]
Ph:
7.4
制法:
将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正ph,加入指示剂,按检验要求分装30ml、10ml、或3ml,并放入一个小倒管,115℃高压灭菌15min。
注1:
双料乳糖发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。
注2:
30ml和10ml乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用,3ml乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
⑷EC肉汤
成分:
胰蛋白胨:
20g
3号胆盐(或混合胆盐):
1.5g
乳糖:
5g
磷酸氢二钾:
4g
磷酸二氢钾:
1.5g
氯化钠:
5g
蒸馏水:
1000ml
制法:
将上述成分混合,溶解后,分装有发酵倒管的试管中,121℃高压灭菌15min,最终ph为6.9±0.2.
⑸磷酸盐缓冲液
成分:
磷酸二氢钾:
34g
1mol/l氢氧化钠溶液:
175ml
蒸馏水:
825ml
PH:
7.2
制法:
先将磷酸溶解于500ml蒸馏水中,用1mol/l氢氧化钠溶液校正PH后,再用蒸馏水稀释至1000ml.稀释液取储存液1.25ml,用蒸馏水稀释至1000ml,分装每瓶100ml或每管10ml,121℃;高压灭菌15min。
0.85%灭菌生理盐水
⑹革兰氏染色液
成分:
结晶紫:
1g
95%乙醇:
20ml
1%草酸铵水溶液:
80ml
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液法混合
革兰氏碘液
成分:
碘:
1g
碘化钾:
2g
蒸馏水:
300ml
将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300ml
沙黄复染液
成分:
沙黄:
0.25g
95%乙醇;10ml
蒸馏水:
90ml
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
染色法:
a将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水先。
b滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
c滴加95%乙醇脱色,约30S;或将乙醇滴满整个涂片,立即倾无能为力,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s.
d水洗,滴加复染液,复染1min。
水洗,待干,镜检。
结果:
革兰氏阳性菌呈紫色。
革兰氏阴性菌呈红色。
注:
亦可用1:
10稀释石炭酸复红染色液作复染液,复染时间公需10s.
2.1.3操作步骤
2.1.3.1检样稀释
a 以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8000~10000r/min的速度处理1min,做成1∶10的均匀稀释液。
b 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1∶100的稀释液。
c 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
d 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种3管。
2.1.3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。
每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
2.1.3.3分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
2.1.3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
2.1.3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
见附录A。
2.1.4粪大肠菌群(faecalcoliform)
2.1.4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
2.1.4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
2.3霉菌和酵母菌
2.3.1培养基和试剂
⑴灭菌蒸馏水
⑵虎红(孟加拉红)培养基
成分:
蛋白胨5g
葡萄糖10g
磷酸二氢钾1g
硫酸镁(含7H2O)0.5g
琼脂20g
1/3000虎红溶液100mL
(四氯四碘荧光素)
蒸馏水1000mL
氯霉素100mg
制法:
将上述前5种成分加入蒸馏水中溶解后,再加入虎红溶液。
分装后,103.43kPa,20min高压灭菌。
另用少量乙醇溶解氯霉素,过滤除菌后,加入培养基中,若无氯霉素,可用链霉素代替,每1000mL培养基加链霉素30mg。
马铃薯-葡萄糖琼脂培养基,附加抗菌素
⑶ 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)
成分:
马铃薯(去皮切块) 300g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
制法:
将马铃薯去皮切块,加1000mL蒸馏水,煮沸10~20min。
用纱布过滤,补加蒸馏水至1000mL。
加入葡萄糖和琼脂,加热溶化,分装,121℃高压灭菌20min。
2.3.2仪器
⑴冰箱:
0~4℃
⑵恒温培养箱25℃-28℃
⑶恒温振荡器
⑷显微镜:
10×~100×
⑸架盘药物天平:
0~500克,精确至0.5克.
⑹菌落计数器.
⑺大镜4×
⑻灭菌吸管:
1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)
⑼灭菌具塞锥形瓶:
300ml
⑽灭菌广口瓶:
500ML
⑾灭菌培养皿直径约90mm
⑿灭菌试管16mm×160mm
⒀灭菌刀、金属勺等。
⒁载玻片、盖玻片、
⒂灭菌牛皮纸袋、塑料袋
2.3.3操作步骤
⑴以无菌操作取检样25克(ML),放放含有225ML灭菌水的具玻塞锥形瓶中,振摇30分钟,即为1:
10稀释液。
⑵用灭菌吸管吸取1:
10稀释液10ML,注入灭菌试管中,另1ML灭菌吸管反复吸取款50次,使霉菌孢子充争散开。
⑶用1ml的灭菌吸管吸取1:
10的稀释液注入含有9ml灭菌水的试管内,另取一支取1ML灭菌吸管吹吸五次,此液为1:
100的稀释液。
⑷按上述操作顺序做工10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一支1ML灭菌吸管,根据对样品污染情况的估计,选择三个合适的稀释度,分别在做10倍稀释的同时,吸取1ML稀释液于灭菌平皿中,每个稀释度做二个平皿,然后将晾置45度左右的培养基注入平皿中,并转动使之与样液混匀,待琼脂凝固后,倒置于25~28度的温箱中,三天后开始观察,共培养观察五天。
⑸计算方法:
通常选择菌落数在10~150之间的平皿进行计数,同稀释度的两个平皿的菌落数平均数乘以稀释倍数,即为每克(或毫升)检样中所含霉菌和酵母菌。
稀释度选择及菌落报告方式可参考GB/T4789。
2
⑹报告:
每克(或亳升)食品所含霉菌和酵母菌数以cfu/g(ml)计。
2.4沙门氏菌检测方法
2.4.1前增菌和增菌
以无菌操作取25g(ml)样品,加在装有225ml缓冲蛋白胨水的500ml广口瓶内。
固体产品先用乳钵加灭菌砂磨碎,于36℃±1℃培养4h,移植10ml转种于100ml氯化镁孔雀绿增菌液内,于42℃培养18h-24h。
同时,另取10ml转种于100ml亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36℃±1℃培养18h-24h。
2.4.2分离
取增菌液1环,划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个DHL琼脂平板(或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板),两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。
于36℃±1℃分别培养18h-24h,观察各个平板上生长的菌落,如发现疑似沙门杆菌的送权威质检部门测定。
2.5志贺氏菌检测方法
2.5.1增菌
以无菌操作取25g(ml)样品,加在装有225mlGN增菌液的广口瓶内。
固体产品先用乳钵加灭菌砂磨碎,于36℃±1℃培养6h-8h。
培养时间视细菌生长情况而定,当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
2.5.2分离
取增菌液1环,划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个;另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板一个,于36℃±1℃分别培养18h-24h,志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
观察各个平板上生长的菌落,如发现疑似志贺氏菌的送权威质检部门测定。
2.6金黄色葡萄球菌检验
2.6.1增菌及分离培养
检样处理:
以无菌操作取25g(ml)样品,加在装有225ml灭菌生理盐水。
固体产品碾磨或置均质器中制成混悬液。
吸取5ml上述混悬液,接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内,于36℃±1℃培养24h。
转种血平板和Baird-Parker平板,36℃±1℃培养24h,挑取血平板上金黄色(有时为白色)菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。
金黄色葡萄球菌形态:
本菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽孢,无荚膜,致病性葡萄球菌菌体较小,直径约为0.5um-1um。
如发现疑似金黄色葡萄球菌的送权威质检部门测定。
2.7溶血性链球菌检验
2.7.1增菌及分离培养
检样处理:
以无菌操作取25g(ml)样品,加在装有225ml灭菌生理盐水。
固体产品碾磨或置均质器中制成混悬液。
吸取5ml上述混悬液,接种于50ml葡萄糖肉浸液肉汤,或直接划线接种于血平板上。
于36℃±1℃培养24h。
挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落,在血平板上分纯,然后观察溶血情况及革兰氏染色,如发现疑似溶血性链球菌的送权威质检部门测定。