若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂
凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。
是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。
较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。
常用的凝胶：
葡聚糖凝胶
琼脂凝胶与琼脂糖凝胶
聚丙烯酰胺凝胶
亲和层析
是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。
酶与底物,酶与竞争性抑制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。
故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.
5、电泳分离
带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。
电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：
纸电泳薄层电泳薄膜电泳凝胶电泳自由电泳
等电聚焦电泳
颗粒在电场中的移动速度主要决定于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。
此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。
6、萃取分离
萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。
萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。
有时也可采用其它流体。
按照两相的组成不同，萃取可以分为：
有机溶剂萃取双水相萃取超临界萃取反胶束萃取
各种双水相系统
聚合物P
聚合物Q或盐
聚丙二醇
甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖
聚乙二醇
聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖
甲基纤维素
羟甲基葡聚糖，葡聚糖
乙基羟乙基纤维素
葡聚糖
羟丙基葡聚糖
葡聚糖
聚蔗糖
葡聚糖
聚乙二醇
硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠
3.6酶的浓缩、干燥与结晶
浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。
在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。
离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。
用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。
蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。
由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。
即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。
纯化方案的设计与评价
一、纯化方案的设计
●
（一）纯化方法的选择依据
●根据有效成分和杂质之间理化性质的差异
●调节溶解度：
沉淀法
2.根据分子大小、形状的不同：
离心分离，膜分离，凝胶过滤3.根据分子电荷性质的不同：
离子交换层析，电泳4.根据专一性结合的方法：
亲和层析5.其它：
吸附层析，疏水层析
二、纯化方案的评价
（一）酶活力测定：
酶活力（enzymeactivity）又称酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定的条件下，酶催化某一化学反应的反应速率来表示。
一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率。
常用的方法：
1.化学分析法（比色法）：
产物可与特定的化学试剂反应生成稳定的有色溶液。
2.分光光度法：
利用底物和产物光吸收性质的不同。
3.量气法：
酶促反应中产物或底物之一为气体。
4.滴定法（pH值测量法）：
产物之一是自由的酸性物质或碱性物质。
多用pH电极测。
常用终止反应方法：
1）改变反应最适条件：
加酸、碱、加热
2）加酶变性剂：
5％三氯乙酸
酶活力单位：
通常采用国际酶学委员会规定的单位。
但在纯化过程中，为了方便，可采用自行规定的单位，只要达到可比较的目的即可，如直接以光密度值表示。
常用比活力表示酶制剂的纯度：
酶活力（u/ml）
比活力＝————————————————
蛋白质含量（mg蛋白/ml酶液）
（二）蛋白质浓度测定
1.紫外吸收法：
酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。
特点：
简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。
2.双缩脲法：
具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。
优点：
快速缺点：
灵敏度差
3.酚试剂（Folin-酚）测定法：
繁琐，但灵敏度、准确度高。
4.染料结合法（考马斯亮蓝染色法
（三）提纯倍数与回收率:
酶的比活力（纯度）=活力单位数/毫克蛋白
比活力越高，酶纯度也越好。
表示酶制剂纯度的一个指标。
纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力
表示提纯过程中纯度提高的倍数。
提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。
总活力＝酶活力单位数酶液总体积
即样品中全部酶活力。
回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％
表示提纯过程中酶损失程度的大小。
回收率越高，损失越小。
判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。
回收率：
反映酶的损失情况。
提纯倍数：
表示方法的有效程度。
一个好的纯化步骤是回收率较高，提纯倍数也较大。
每一步总活性将减少，比活性应明显提高。
酶制剂的保存
●
（1）温度酶的保存温度一般在0～4℃，但有些酶在低温下反而容易失活，因为在低温下亚基间的疏水作用减弱会引起酶的解离。
●
（2）缓冲液大多数酶在特定的pH范围内稳定，偏离这个范围便会失活，这个范围因酶而异，如溶菌酶在酸性区稳定，而固氮酶则在中性偏碱区稳定。
●（3）氧化／还原由于巯基等酶分子基团或Fe-S中心等容易为氧化剂所氧化，故这类
●酶应加巯基或其他还原剂加以保护或在氩气或氮气中保存。
●（4）蛋白质的浓度及纯度一般地说，酶的浓度越高，酶越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。
此外，还可通过加入酶的各种稳定剂如底物、辅酶、无机离子等来加强酶稳定性，延长酶的保存时间。
固定化
⏹固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。
游离酶的缺点
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。
2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。
3.分离纯化困难。
一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点
1.固定化酶（immobilizedenzyme）
固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。
优点：
（1）可提高稳定性。
（2）能回收，易与产物分离，可反复使用。
缺点：
（1）存在扩散限制。
适于催化小分子物质。
（2）酶活性下降
2.固定化细胞（immobilizedcell）
固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。
优越性：
（1）降低成本，省去酶的分离纯化工作;
（2）既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。
局限性：
（1）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。
（2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
3.固定化原生质体
意义：
（1）固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。
（2）原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。
1.吸附法（adsorption
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physicaladsortion）
作用力：
氢键、疏水键
常用载体：
氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。
2）离子结合法（ionbinding）
作用力：
离子键
常用载体：
DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-
纤维素
优点：
条件温和，操作简便，酶活力损失少。
缺点：
结合力弱，易解吸附。
2.共价偶联法（covalentbindingorcovalentcoupling）
借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。
1）载体：
亲水载体优于疏水载体
如:
天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶亲和性好，机械性能差
琼脂糖
合成聚合物：
聚丙烯酰胺
聚苯乙烯机械性能好，但有疏水结构
尼龙
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：
功能基团：
芳香氨基，羧基，羧甲基等。
•酶分子:
侧链非必需基团：
羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：
重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：
酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。
•缺点：
反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应,使酶蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：
交联法不使用载体。
交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。
•酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。
•酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。
缺点：
（1）反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。
（2）制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。
4.包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。
分为：
网格型：
将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。
微囊型：
将酶包埋在高分子半透膜中。
凝胶
包埋条件
酶活性
强度
天然凝胶
琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶
温和
不变
差
合成凝胶
聚丙烯酰胺、光交联树脂
聚合反应
部分失活
高
2）微囊型包埋法（microencapsulation）又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。
半透膜：
直径几十微米到几百微米，厚约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：
1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。
2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。
缺点：
反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：
优点：
不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。
缺点：
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
2.固定化方法
1）直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2）吸附法
3）包埋法
（三）原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。
常用凝胶：
琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。
注意：
一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。
第二节 固定化酶和固定化细胞
的性质与表征
一、固定化酶的性质
影响酶催化活性的因素
1.构象改变或立体屏蔽以及微扰
2.分配效应和扩散限制效应
（一）酶的活性：
通常低于天然酶（有例外）。
（二）酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。
可能的原因：
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，
可防止酶分子伸展变形；
②抑制酶的自身降解。
③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
（三）酶的最适温度
最适温度与酶稳定性有关。
多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。
（四）酶的最适pH
带负电荷载体：
最适pH向碱性偏移。
带正电荷载体：
最适pH向酸性偏移。
二、固定化细胞的性质
与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。
（1）有活性升高的现象。
（2）稳定性的增加。
（3）最适温度和最适pH常保持不变。
三、固定化酶（细胞）的评价指标
（一）酶（细胞）的活力
固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。
（二）蛋白总量1.双辛可宁酸法（BCA法）2.考马斯亮蓝法
（三）偶联率及相对活力
偶联率=（加入蛋白活力一上清液蛋白活力）/加入蛋白活力×100%
活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力×100%
相对活力=固定化酶总活力/（加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力）×100%
（四）半衰期
在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。
是衡量稳定性的一项重要指标。
二、固定化酶在医学上的应用
1.消血栓：
⏹纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。
⏹酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。
用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。
2.人工肾：
原理：
将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。
即：
用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。
三、在分析检测中的应用
1.固定化酶和电化学传感器的结合。
2.酶传感器
优点：
①既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；
②酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。
酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成：
固定化酶膜：
选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；
变换器：
把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来
2）酶传感器的应用
⏹水质监测
用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。
从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。
2.酶联免疫测定
1）将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。
制成酶标抗体（或酶标抗原）；
（2）将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶－抗体－抗原复合物。
通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。
第一节酶反应器的特点与类型
•定义：
以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器（Enzymereactor）。
•作用：
以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物。
•与化学反应器相比：
在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能较少。
•与发酵反应器相比：
不表现自催化方式（即细胞的连续再生）。
⏹按结构区分
⏹搅拌罐式反应器（Stirr
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