华理分子生物学实验.docx

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华理分子生物学实验

曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析

接入载体为pET-28a，外源基因为AFL-1，PCR产物直接酶切（NdeI/BamHI）后纯化连接pET28a

外源基因信息：

.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?

term=3504452

AFL1-1（GeneID=3504452）序列信息统计如下：

1atggcttctccaattctgcgatcaccgattacttcggacctcgccaacgtaacacccgat

61ttggtggatgttagcactcccgaaaaattgaaatcctaccgcgaatcacttgaaccaatc

121ttcactttggagaatatcatccgagggaaagagaacatcatctcctacgaggaactggac

181atcccaggccccgcaggaccgatgcgggccaccatcttccgccccaagcaccaaacccac

241cctatcgatgaaatccctggtatcctacacatccacggcgggggcctcgccacgggaaac

301cgcttcctgggcttcaccatgctcgactgggtcgagtccctcggtgccgtctgcctgacg

361gccgagtaccgtctcgccccggaacatcaccagcccgcccagctggaagacagctacgcc

421gcgctgcagtggatgagcgaccacgccgccgagctgggcttcaacccgcgcaagctggtt

481gtctgcggtagctcggcggggggcaatctcacggcgggggtcaccttactcgcgcgggac

541cgctcgggcccgcaaatccgcggccaggtgttgatctatccgtgggttgacgatggcatg

601gactacgtgtccatgcggcagtatgcggatattgcgcctgtgagggacgtggacgccgcc

661gtgttggctaattatgcgtttggcgagaggcgcgagcacgcggatatgtatactgtgccg

721atgcgcgcgacgaatttcgcgggcttgcccccgacgtttatcgatgtgggtgaggcggat

781gtgtttcgtgatcaggatatcgcgtacgcgtcggctttgtggaaggatggtgtctcgact

841gagttgcatctgtggccgggcagttggcatgggtttgatgtctttgttcctgatgctccc

901attagtcggcgggcgagggctgctcggttggaatggcttcggaagttgttaagtgtgcct

外源基因PCR扩增引物序列：

P1:

5’GCGCGGCAGCCATATGGCTTCTCCAATTCTGCGA3’

P2:

5’GCTCGAATTCGGATCCAGGCACACTTAACAACTTCCGAAG3’

N端保留了标签，用于亲和层析

实验流程安排

第一天外源基因的制备

涉及实验：

PCR、酶切、电泳、回收

掌握实验原理：

PCR及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收

实验顺序：

PCR扩增-->电泳-->纯化-->酶切-->电泳-->割胶及回收-->载体接种

进度限制点：

PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行

上交样品：

外源基因回收样品，标记好组号

外源基因的PCR制备体系

1#2#

总体积50l50l

ddH2O35l34l

10×buffer5l5l

dNTP（2.5mM）4l4l

P1（5pmol/l）2l2l

P2（5pmol/l）2l2l

模板DNA1l2l

Taq酶（5U/l）0.25l0.5l

PCR反应条件：

退火温度61度30s，延伸时间1min。

预变性：

95度，5min，

变性95度，30s，

退火61度，30s，

延伸72度，1min，

30循环。

延伸72度，10min，

4度保存。

或取出实验，或取出后-20度保存。

PCR回收样品的酶切体系

总体积ddH2OPCR回收产物BufferNdeI/BamHI

40l15l20l4l0.6+0.6l

酶切反应条件：

37度水浴保温30min。

PCR产物纯化：

产品说明书

DNA片段回收：

胶回收试剂盒说明书

思考问题：

1.PCR中的退火温度和延伸时间如何确定？

产物浓度不高的原因？

2.PCR实验中如果出现无产物，该如何分析原因？

3.PCR扩增产物如果保证其准确性？

如果出现扩增基因点突变时，有何解决方法？

4.电泳中针对300bp和5.6kb的片段，胶浓度如何选择？

5.胶回收过程中出现无产物带时，如何选择原因？

第二天载体质粒的制备

涉及实验：

质粒抽提、酶切、电泳、回收、连接

掌握实验原理：

质粒抽提、连接及体系确定

实验顺序：

抽提质粒-->电泳-->酶切-->电泳-->割胶回收-->电泳-->连接-->感受态接种

进度限制点：

均为各组独立实验，无限制点

上交样品：

载体质粒（P）、载体酶切片段（F）、连接样品（L），标记组号

质粒提取：

产品说明书

载体质粒双酶切

Total40μl

ddH2O34-Xμl

10×buffer4μl

质粒DNAXμl

NdeI/BamHI1+1μl

酶切反应条件：

37度水浴保温30min。

正常情况下，全做酶切。

（因回收后条带较淡）

连接体系

∑10×Buffer载体片段外源片段T4DNA连接酶

15l1.5lXlYl0.5l

连接反应条件：

4度水浴保温过夜。

思考问题：

1.质粒的拷贝数通常有哪些？

对于低拷贝质粒的制备该如何进行？

2.未酶切的质粒正常带型是如何分布的？

如出现异常现象该如何处理？

3.双酶切如发生酶切不完全时，产物带如何分析？

在电泳中如果观察？

4.重组质粒构建中外源和载体的投入量如何确定？

针对不同粘性末端的DNA片段连接该注意什么？

5.大体积酶切（如1ml体积，DNA量为毫克级）该如何设计酶切体系和酶切时间？

第三天转化与RNA抽提

涉及实验：

感受态细胞制备、转化、RNA抽提

掌握实验原理：

细菌细胞感受状态、转化、细菌RNA抽提

实验顺序：

翻瓶（7:

30）-->感受态细胞制备-->RNA抽提-->转化-->RNA样品电泳-->涂板

进度限制点：

冷冻离心和操净台公用

上交样品：

涂布平板2块/组，统一放置37度培养箱

大肠杆菌感受态细胞的制备

1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上，37℃下隔夜培养。

2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中，37℃下隔夜培养。

3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mlLB培养基中。

4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时，OD600接近0.5。

（以上步骤教师完成）

5.4℃，6000rpm离心10分钟收获菌体。

1.0ml/管，4管/组

6.上述菌体沉淀用100l/管的100mmol/LCaCl2（冰冻）悬浮，并合并于一管，4℃,6000rpm离心10分钟。

7.弃上清，将沉淀用100l的100mmol/lCaCl2（冰冻）重新悬浮。

8.冰水浴中放置3-5h放可使用。

RNA抽提：

产品说明书

大肠杆菌的转化

1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。

2.在90l感受态细胞悬浮液，加入6lDNA连接溶液，轻轻混匀，在冰水浴中放置30分钟。

3.混匀，42℃水浴中脉冲2分钟，快速转移至冰水浴中，加入900lLB培养基，37℃摇床培养1~1.5小时。

（42℃热脉冲前混匀菌体）

4.吸取适量已转化的感受态细胞涂布于100g/ml卡那霉素的LB平板上。

（涂布量确定？

本次实验离心后弃上清850l，离心条件4℃，6000rpm，5min）

5.37℃下倒置培养12~16小时后计数。

思考问题：

1.大肠杆菌转化除了感受态细胞转化方法外，还有哪些方法？

2.细菌RNA的半衰期特点？

如何判断RNA的抽提质量？

3.抽提RNA过程中为何要带手套和口罩？

常规DNA电泳可以分析RNA抽提质量否？

4.转化子筛选原理？

一般筛选中还有哪些方法？

5.转化完成最后筛选平板上几乎没有转化子，转化失败可能的原因有哪些？

第四天重组子鉴定与转录水平的表达分析

涉及实验：

转化计数、单菌落接种、菌落PCR、RT-PCR

掌握实验原理：

转化子与重组子、RT-PCR

实验顺序：

菌落接种（Eppedorf）-->RT-PCR-->电泳-->菌落PCR-->电泳-->接种

进度限制点：

PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行

上交样品：

接种重组子的试管1根/组，统一放置37度摇床培养

逆转录体系（电子产品说明书RR037A）

∑5×Buffer（含dNTP）EnzymeMixOligodTRandom6mersRNARNAFreedH2O

10l2l0.5l0.5l0.5l1l5.5l

对照∑5×BufferEnzymeMixOligodTRandom6mersRNARNAFreedH2O

10l2l0l0.5l0.5l1l6l

逆转录反应条件：

37℃15min

85℃5sec

PCR体系：

逆转录组对照组

总体积20l20l

ddH2O7l7l

2×MIX10l10l

P1（5pmol/l）1l1l

P2（5pmol/l）1l1l

模板DNA（逆转录溶液）1l1l

菌落PCR

总体积25l

ddH2O10l

2×MIX12.5l

P1（5pmol/l）1l

P2（5pmol/l）1l

模板DNA（菌液）0.5l

每组完成4个菌落的PCR鉴定，其中BL21（DE3）和DH5a各两个；

PCR反应条件：

退火温度61度30s，延伸时间1min。

预变性：

95度，5min，

变性95度，30s，

退火61度，30s，

延伸72度，1min，

30循环。

延伸72度，10min，

电泳鉴定。

思考问题：

1.逆转录过程中需要注意RNA酶污染情况否？

为什么？

2.RT-PCR是定性分析外源基因表达情况？

如果要进行定量分析外源基因表达情况，如何设定参？

3.菌落PCR的模板DNA来源何处？

为何能直接以菌液模板进行PCR？

血液样品可否直接PCR？

4.PCR预混液主要包括哪些组份？

如进行批量转化子的菌落PCR鉴定，如何实验可以大大节约时间？

如果没有购买预混液，可否自行配制？

如果进行？

第五天重组菌的蛋白表达

涉及实验：

重组菌表达、SDS-PAGE灌胶、蛋白电泳

掌握实验原理：

诱导、SDS-PAGE电泳

实验顺序：

翻瓶-->制分离胶-->诱导-->制浓缩胶-->菌体样品处理-->点样电泳

进度限制点：

菌体培养摇床公用

上交样品：

无

SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配制

组分分离胶（l）浓缩胶（l）

双蒸水16502700

30％丙烯酰胺2000670

（甲叉双丙烯酰胺）

分离胶缓冲液（PH8.8）1250—

浓缩胶缓冲液（PH6.8）—500

10％SDS5040

10％过硫酸铵5040

TEMED2.52.5

总体积50004000

菌体电泳样的制备

将菌体均匀悬浮，测OD600，若>1，则稀释，离心，弃上清，按照1OD/1ml沉淀中加入100µl1*loadingbuffer（50水+50µl2*loadingbuffer），悬浮，沸水浴5min，离心后，3µl上样。

例如：

若OD600nm为0.6，体积为0.5，则所得沉淀中相应加入

0.6*0.5=30µl1*loadingbuffer（15µl水+15µl2*loadingbuffer）

资料复印：

上述6页、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒和RNA抽提试剂盒的说明书

讲解容：

周一（准备）：

移液器使用、实验总体克隆方案、整个实验周期需要注意的问题（实验的连续性及空余时间的利用、实验的安全、实验报告--总结报告）

周二（Day1）：

PCR基本原理、基因克隆中PCR的常规难点（模板----DNA、cDNA）、利用基因同源序列进行全长克隆的方法、模板和酶的优化等问题

周三（Day2）：

质粒抽提的基本原理（碱裂解法、低拷贝大质粒的抽提方法、特殊受体来源的抽提方法）、限制性切酶的定义、酶切体系的设计、多样品同种酶切的实验快速方法、大量DNA酶切的方法、联合酶切、不同公司来源的酶混合联用等，快切酶技术等。

周四（Day3）：

感受态细胞类型（克隆受体、表达受体）、DNA连接效率的决定因素、转化效率的限制因素、转化实验的对照设置及转化效率低的原因分析、RNA抽提原理等

周五（Day4）：

重组鉴定的方法（标记基因、PCR鉴定、酶切鉴定、测序验证）、PCR模板（菌液、血液。

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）、RT-PCR的定性和定量分析与参选择

周六（Day5）：

表达系统（大肠杆菌、链霉菌、酵母、动物细胞。

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）