细菌简单染色和革兰染色.docx
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细菌简单染色和革兰染色
实验二细菌的简单染色和革兰染色
一、实验目的
1、学习无菌操作技术,掌握细菌涂片的制作方法。
2、掌握细菌简单染色法和革兰染色法的原理及操作步骤,识别细菌的革兰染色结果。
3、巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理
细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷,所以通常采用带正电荷的碱性染料(如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。
当细菌分解糖类产酸时,细菌所带正电荷增加易被带负电荷的酸性染料(如伊红、酸性复红或刚果红)着色。
简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
革兰氏染色法(GramStaining)由丹麦病理学家ChristianGram于1884年创立,是细菌学中很重要的鉴别染色法,因为通过此法染色,可将细菌鉴别分类为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)这两种类型。
革兰氏染色法之所以能够将细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类,是因为这两类菌的细胞壁结构和成分不同。
一般认为革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄,脂肪含量高,经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态,细胞壁孔径大,不能阻止溶剂透入,因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色,再经蕃红复染就染成了红色;革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚,经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小,结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色。
虽然如此,革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别,也有物理结构不同的结果,因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同,但具有革兰染色阳性反应。
三、实验器材
1、菌种:
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、待鉴定的未知菌S1和S3。
2、仪器及其他用品:
显微镜、酒精灯、打火机、接种环、载玻片、盖玻片、擦镜纸、擦镜液、吸水纸、镜油、无菌牙签。
3、简单染液:
草酸铵甲紫染液、番红染液。
4、革兰染液:
草酸铵甲紫染液、革氏碘液、95%乙醇溶液、番红染液
四、实验步骤
(一)简单染色
1、载玻片的处理:
从乙醇溶液中取出洗干净的载玻片,用吸水纸擦干,将要涂菌的部位在酒精灯火焰上烤一下,去除油脂,冷却待用。
2、涂片:
左手持菌液试管,右手持接种环在火焰上灼烧待冷却后,用接种环从试管枯草芽孢杆菌培养液中取一环菌,于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可,或先滴一小滴无菌水于载玻片中央,用接种环从斜面上挑出少许,与载玻片上的水滴混合均匀,涂成一薄层。
注意在拔或塞试管塞时,应将试管口在火焰处略加烧灼,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
3、干燥:
涂片后室温下自然干燥。
4、固定:
手持载玻片一端使标本面朝上,在酒精灯的火焰外侧快速来回移动2~3次,要求玻片温度不超过60℃,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜,放置待冷后染色。
固定的目的是杀死微生物,固定其细胞结构,保证菌体能牢固地粘附在载玻片上,以免水洗时被水冲掉。
5、染色:
在固定好的涂片标记处滴加1滴草酸铵甲紫染液,染色1min。
6、水洗:
缓慢冲洗染液,吸干。
7、实验搭档改用大肠杆菌培养液和番红染液,同时操作以上步骤。
8、镜检:
观察两个标本,区分辨别染成的紫色和红色。
(二)革兰染色
1、制片:
分别取大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、酵母菌、未知菌S1和S3的菌液制成涂片,干燥,固定。
2、初染:
滴加1滴草酸铵甲紫染液,染色1min,水洗,吸干。
3、媒染:
再加1滴碘液覆盖涂片1min,水洗。
4、脱色:
用吸水纸吸去玻片上的残留水,用滴管滴加95%的乙醇脱色,轻轻摇动玻片直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。
5、复染:
滴加蕃红染液复染3min,水洗。
6、镜检:
吸干水后,盖上盖玻片观察标本,观察时注意细菌形态、大小、排列和颜色。
(三)选做实验
在干净的载波片上滴加半滴水,用无菌牙签取一点牙垢,涂抹在水滴上,制成涂片后,进行革兰氏染色后观察。
五、实验结果与讨论
1、革兰染色照片结果(见下一页)
(1)枯草杆菌
图1枯草杆菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,枯草杆菌染色结果为紫色,是革兰氏阳性菌(G+)。
注:
图中红色箭头所指的特殊结构——芽孢。
(2)酵母菌
图2酵母菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,酵母菌染色结果为紫色,是革兰氏阳性菌(G+)。
注:
图中红色箭头所示为出芽现象。
(3)金黄色葡萄球菌
图3金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,金黄色葡萄球菌染色结果为紫色,是革兰氏阳性菌(G+)。
注:
从图中可以清晰地观察到葡萄球状的细菌形态。
(4)大肠杆菌
图4大肠杆菌革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,大肠杆菌染色结果为红色,是革兰氏阴性菌(G—)。
(5)未知菌液S1
图5未知菌液S1涂片革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,菌液中有两种主要的细菌。
注:
红色箭头所示的未知菌的染色结果为紫色,是革兰氏阳性菌(G+),由细菌形态推测为一种杆菌;蓝色箭头所示的未知菌的染色结果为红色,是革兰氏阴性菌(G—),由细菌形态推测为一种球菌。
(6)未知菌液S3
图6未知菌液S3涂片革兰氏染色结果,10×100
如上图所示,菌液中只有一种主要的细菌。
注:
红色箭头所示的未知菌的染色结果为红色,是革兰氏阴性菌(G—),由细菌形态推测为一种球菌或葡萄球菌。
(7)牙垢
图6牙垢涂片中微生物染色结果,10×100
牙垢中含有多种细菌,多数染色为紫色,是革兰氏阳性菌(G+),如红色箭头所示为革兰氏阳性杆菌。
2、革兰染色观察结果列表
菌种
鉴定结果
细菌颜色
细菌形状(形状和聚集状态)
枯草芽孢杆菌
G+(阳性)
紫色
杆状菌,较分散,偶有成链状
酵母菌
G+(阳性)
紫色
球状菌,双球状或团状聚集
金黄色葡萄球菌
G+(阳性)
紫色
球状菌,葡萄球状聚集
大肠杆菌
G-(阴性)
红色
球杆状菌,分散排列
S1未知菌种1
G+(阳性)
紫色
链杆状菌,较分散
S1未知菌种2
G-(阴性)
红色
球状菌,分散排列
S3未知菌种
G-(阴性)
红色
球状菌,密集排列,有葡萄球状聚集
3、思考题
(1)分析影响某一微生物革兰染色结果的因素。
答:
菌龄:
染色所用的细菌最好是出于对数生长期的细菌。
因为此时细菌生长旺盛,个体数目较多,便于观察。
若菌龄过大,细菌大量死亡或部分菌自然溶解,造成细胞壁通透,阳性菌出现假阴性,使得染色结果受到干扰,不准确。
载玻片清洁:
载玻片应清洁无油脂,可以在酒精等火燃上烤一下以去除油脂。
涂片厚度:
涂片厚度太薄,会使细菌过于稀少,但也不宜太厚,因为过厚会使菌体堆积,影响观察,同时染色时可能会残留结晶紫染料,易出现假阳性。
干燥温度:
最好让细菌涂片自然干燥。
如果在火焰上略加灼烧令其干燥,温度不能超过60度,若温度太高则菌体变形。
热固定温度:
将已干燥的涂片在火焰上通过3-4次,温度不超过60度,以手背接触不烫为宜。
温度低则菌体固定不牢,水洗时易被冲去;温度高菌体发生变形。
染色:
初染色时间应控制在30s~1min为宜。
如果染色时间过短,不利于初染液结晶紫与细胞结合,造成阳性菌呈阴性结果。
而染色时间过长,不易脱色,易使阴性菌呈假阳性。
乙醇脱色:
脱色时间最好在10~20s,以恰好洗脱液物色为准,如果时间过长,革兰阳性菌也有可能被脱色,结果呈假阴性。
而若脱色时间不足,革兰阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫-碘的复合物不能被洗脱出来,结果呈假阳性。
(2)思考一下,我们平常使用的甲紫药水杀菌机理。
答:
龙胆紫为碱性阳离子染料,其阳离子能与细菌蛋白质的羧基结合,从而影响其代谢,对革兰氏阳性菌有选择性抑制作用,因而产生杀菌作用。
一般医用的紫药水是龙胆紫的1%~2%水溶液或酒精溶液,是常用的外用药。
对革兰氏阳性菌、绿脓杆菌、及真菌(如念珠菌以及皮肤癣菌等)有较强杀菌作用,对革兰氏阴性菌和抗酸菌作用不显著。
对组织无刺激性。
六、实验小结
这堂课学习了革兰氏染色方法,由于陈老师对细节讲解得很到位,实验过程十分顺利。
这堂课我还和周围的同学进行了讨论交流,彼此交换了经验,使得实验更加流畅、实验原理更加明了。
最后还要感谢陈老师、麻老师和各位助教的耐心细心的讲解和指导。
七、参考文献
陈金春、陈国强主编,《微生物学实验指导》,清华大学出版社,2005年8月