土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx

《土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法

土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法

土壤酶活性测定

取样工具及取样方法

在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时刻、地点、环境条件等，以备查考。

土样在自然条件下烘干装入袋中备用。

所需试剂：

酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[（NH4）2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、

配置方法：

铵态氮标准溶液：

称取0.4717g（精确至0.0001g）干燥的硫酸铵[（NH4）2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µgN。

往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。

醋酸缓冲液：

PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。

硼酸缓冲液：

PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。

纳氏试剂：

将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。

加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。

静置，取上层清液，贮于棕色瓶中

酚的标准溶液：

（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，

（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。

测定方法

磷酸酶活性测定

试验原理

土壤中的磷，专门大部分以有机磷化合物的形式存在。

磷酸酶能促进有机磷化合物的水解。

实验表明，土壤微生物关于土壤含磷有机物质的矿化起着要紧作用；土壤的磷酸酶活性，在专门大程度上取决于土壤的腐殖质含量，活性磷量，能矿化有机磷化合物的微生物数量，植物类型等因素，土壤的磷酸酶活性能够表征土壤的肥力状况。

实验仪器

恒温箱、分光光度计、

实验药品

甲苯、苯磷酸二钠、酚、醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、

实验步骤

取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8（16滴）毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。

认真混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对比。

为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳固时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，按照用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。

磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示。

脲酶活性测定

试验原理

土壤的脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正有关。

根基土壤可测得最大的脲酶活性，人们常用土壤的脲酶活性表征土壤的氮素状况。

实验仪器

锥形瓶、定性滤纸、震荡器、分光光度计、1mm筛、

实验药品

酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、铵态氮标准溶液、双蒸水

实验步骤

准确称取10.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入50mL20%的NaCl溶液，将瓶塞紧，在振荡30min（120r/min）后，用定性滤纸过滤。

取20mL滤液于50mL容量瓶中，加双蒸水稀释至40mL左右，加2mL25%酒石酸钠，充分摇动静置5min，使其与Cd，Mg离子络合；

再加入10滴1%阿拉伯胶，摇动后加2mL纳氏试剂，边加边摇，定容至刻度，5min后用490nm比色，配制铵态氮标准溶液，绘制标准曲线，比色后求算土壤脲酶活性。

结果分析

滴定法测定过氧化氢酶活性

试验原理

土壤的过氧化物酶活性，与土壤的呼吸强度和土壤微生物活动有关，在一定程度上反映土壤微生物过程的强度。

根际土壤的过氧化物酶活性，远较根际外土壤为高。

有机质含量高的土壤，过氧化氢酶活性较强。

因此，土壤过氧化物酶的活性能够表征土壤总的生物学活性和肥力状况。

本试验采纳滴定法测定过氧化氢酶活性，即通过定量滴定酶促反应后剩余的过氧化氢量。

实验仪器

致密滤纸、酸式滴定管、1mm筛

实验药品

双蒸馏水、H2SO4、过氧化氢、KMnO4、

实验步骤

准确称取5.00g过1mm筛的风干土样，置于150mL锥形瓶中，注入40mL双蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢，另设对比，塞紧瓶盖，振荡30min（120r/min）后，注入5mL1.5mol/LH2SO4终止反应，用致密滤纸过滤，取滤液25mL，用0.1mol/LKMnO4滴定至微红色。

土壤的过氧化氢酶活性，用100g土重的0.1mol/LKMnO4毫升数表示。

土壤微生物检测

一、取样工具

无菌刮铲、土样采集器、镊子、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。

二、采土方式：

在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时刻、地点、环境条件等，以备查考。

为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品赶忙进行处理或放在4℃冰箱中暂存。

三、所需培养基及配置方法

1、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）

   牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。

2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）

   可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4 .7H2O0.5g，FeSO4  0.01g，琼脂20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。

121℃灭菌20min。

3、无氮培养基（自身固氮菌、钾细菌）

  甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·2H2O0.2g，CaCO35g，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。

4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）

   葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。

临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30µg。

蛋白胨琼脂培养基

蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。

四、所需药品

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、MgSO4、FeSO4 、  甘露醇（或葡萄糖）、CaSO4·2H2O、CaCO3、孟加拉红、链霉素

五、检测方法

土壤中放线菌的检测

试验原理

应用稀释平板法从土壤中检测放线菌

实验仪器及试剂

7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶

高氏一号培养基

可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4  0.01g，琼脂20g，水 1000ml，pH7.2～7.4。

配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000ml。

121℃灭菌20min。

实验步骤

在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。

用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。

如此操作，一直到10-10。

稀释。

（另外，要明白所称土样的含水量）

倒人45℃恒温水浴的灭菌高氏l号培养基，水平放置，凝固待用；分别无菌吸取各样品10-4、10-5、10-6、10-7稀释液，加入灭菌平皿中（每稀释度3皿，每皿lml），用玻璃涂布棒涂抹平均，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。

放线菌的培养时刻较长，故制平板的培养基用量可适当增多

培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行运算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。

每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中细菌的检测

试验原理

应用稀释平板法从土壤中分离细菌

实验仪器及试剂

7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶

牛肉膏蛋白胨培养基

   牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl   5g，琼脂15～20g，水1000ml，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min。

实验步骤

在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。

用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。

如此操作，一直到10-10。

稀释。

（另外，要明白所称土样的含水量）

2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中（每稀释度3皿，每皿lml），倒人45℃恒温水浴的灭菌牛肉膏蛋白胨培养基，混匀。

（稀释倍数是情形而定）

3、待培养基凝固后，将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养。

4、培养24h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行运算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。

每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中真菌的检测

一、试验原理

应用稀释平板法从土壤中检测真菌

二、实验仪器及试剂

7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水

马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）

   葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）100ml，琼脂15～20g，pH自然，蒸馏水800ml，121度灭菌30min。

临用前加入0.03%链霉稀释液10ml，使每毫升培养基中含链霉素30µg。

（链霉素在培养基融解并冷却至50摄氏度时加入，用剩的链霉素在冰箱可储存4个月，但每过一月，在1升培养基中需多加0.1ml）。

三、实验步骤

1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。

用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。

如此操作，一直到10-10。

稀释。

（另外，要明白所称土样的含水量）

2、分别无菌吸取各样品10-2、10-3、10-4、10-5稀释液，加入灭菌平皿中（每稀释度3皿，每皿lml），倒人45℃恒温水浴的灭菌马丁氏（Martin）琼脂培养基，混匀。

（稀释倍数是情形而定）

3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。

4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行运算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。

每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中自身固氮菌的检测

一、试验原理

应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。

二、实验仪器及试剂

7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水

无氮培养基

  甘露醇（或葡萄糖）10g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·2H2O5g，CaCO31000ml，蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，113℃灭菌30min。

三、实验步骤

1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。

用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。

如此操作，一直到10-10。

稀释。

（另外，要明白所称土样的含水量）

2、分别无菌吸取各样品10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，加入灭菌平皿中（每稀释度3皿，每皿lml），倒人45℃恒温水浴的灭菌无氮培养基，混匀。

（稀释倍数视情形而定）

3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。

4、培养48h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行运算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。

每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

土壤中氨化细菌的检测

一、试验原理

应用稀释平板法从土壤中检测自身固氮菌。

二、实验仪器及试剂

7个土样，3个重复，共需252个灭菌培养皿；灭菌试管、灭菌吸管、灭菌三角烧瓶、灭菌水

蛋白胨琼脂培养基

蛋白胨5克、KH2PO40.5g，NaCl0.25g，琼脂18克，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO40.01克，水1000毫升，pH7.2，一气压灭菌20分钟灭菌。

三、实验步骤

1、在超净工作台中，无菌称取所取土样10g，分别溶于装90ml无菌水及玻璃珠三角瓶中，于摇床震荡30分钟。

用移液管分别无菌吸取各样品土壤悬液1ml移入装9ml无菌水试管中，此即为10-2稀释的土壤悬液。

如此操作，一直到10-10。

稀释。

（另外，要明白所称土样的含水量）

2、分别无菌吸取各样品10-6、10-7、10-8、10-9稀释液，加入灭菌平皿中（每稀释度3皿，每皿lml），倒人45℃恒温水浴的灭菌蛋白胨琼脂培养基，混匀。

（稀释倍数视情形而定）

3、待培养基凝固后，将平皿倒置于28℃恒温培养箱中培养。

4、培养48h-72h后，取出培养平皿，选出土样适合菌落计数的稀释度，算出同一稀释度3个平皿上的菌落平均数（选择平均菌落数在30-300之间的），并按下列公式进行运算，最后换算成每克干土壤中菌落形成单位。

每克土壤中菌落形成单位＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数。

试剂购买

序号

试剂名称

规格

需要数量（单位：

瓶）

实验室现有药品

备注

1

牛肉膏

500g/瓶

1瓶

有

未专门注明，所用化学试剂均为分析纯

2

蛋白胨

500g/瓶

2瓶

3

琼脂

500g/瓶

4

4

可溶性淀粉

500g/瓶

2

5

葡萄糖

500g/瓶

3

6

氯化钠

500g/瓶

1

有

7

硝酸钾

100g

1

有

8

磷酸氢二钾

500g

1

有

9

7水硫酸镁

500g/瓶

1

有

10

硫酸亚铁

500g/瓶

1

有

11

2水硫酸钙

500g/瓶

1

有

12

碳酸钙

250g/瓶

1

有

13

14

孟加拉红

最小包装

15

链霉素

25g/瓶

1

16

酒石酸钠

100g/瓶

1

17

阿拉伯胶

100g/瓶

1

18

碘化钾

50g/瓶

1

有

19

氯化汞

50g/瓶

1

20

氢氧化钾

500g/瓶

1

21

硫酸铵

500g/瓶

1

22

甲苯

200ml左右

23

苯磷酸二钠

10g左右

24

NaAc.3H2O

500g/瓶

1

25

乙酸

500ml/瓶

1

有

26

酚

100g/瓶

1

有

27

铁氰化钾

100g/瓶

1

28

4-氨基安替吡啉

25g/瓶

1

29

硼酸

500ml/瓶

1

有

30

硼砂

500g/瓶

1

31

三氯乙酸

500g/瓶

1

32

硫代巴比妥酸（TBA）

最小包装

33

丙酮

500ml/瓶

1

有

34

氮蓝四唑

100mg/瓶

1

35

36