基因家族分析套路.docx
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基因家族分析套路
基因家族分析套路
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基因家族分析套路
（一）
近年来，测序价格的下降，导致越来越多的基因组完成了测序，在数据库中形成了大量的可用资源。
如何利用这些资源呢？
今天小编带你认识一下不测序也能发文章的思路－-全基因组基因家族成员鉴定与分析（现在这一领域可是很热奥）;
一、基本分析内容
⏹数据库检索与成员鉴定
⏹进化树构建
⏹保守domain和mｏtiｆ分析.
⏹基因结构分析．
⏹转录组或荧光定量表达分析.
二、数据库检索与成员鉴定
１、数据库检索
１）首先了解数据库用法,学会下载你要分析物种的基因组相关数据。
一般也就是下面这些数据库了
⏹Bｒaｃhypoｄiumdb:
⏹TAIR:
⏹Ｒiｃｅ Gｅnome Annotation Project ：
.
⏹Phytoｚｏmｅ:
⏹Ｅnseｍble:
⏹ＮＣBI基因组数据库：
２）已鉴定的家族成员获取。
如何获得其他物种已发表某个基因家族的所有成员呢,最简单的就是下载该物种蛋白序列文件（可以从上述数据库中下载）,然后按照文章中的ID,找到对应成员。
对于没有全基因组鉴定的,可以下列数据库中找:
a. ＮＣＢＩ:
nucleotidｅ anｄ protein dｂ.
b. EBI:
.
c. UｎiPrｏtKB：
2、比对工具。
一般使用blast和hmmｅr,具体使用命令如下：
⏹Ｌocaｌ BLAST
formatdb–i ｄb．faｓ–p F／T;
blａstａll–p blａｓｔp（oｒelse） –i knｏwn．fas–ｄ db.fas–m 8 –ｂ 2（or elｓe） e 1e-5 –o alignrｅsｕｌｔ．ｔxt.
-b:
oｕtｐut tｗｏ ｄｉffｅreｎｔ mｅmｂers in subｊeｃt ｓｅquｅncｅs （ｄｂ）.
⏹Hmmer （ｈiddｅn Mａｒkov Modｅｌ） ｓearｃh. Thesame as PSI－BLAＳT in ｆｕncｔion． It has a hiｇher sｅnｓｉtivitｙ, but ｔhｅ sｐeed islower.
Command：
hｍmbuild--inforｍataｆaｋnowｎ.hmｍａｌｉgnknown．fa;
hｍmｓearchｋnown.hmmｄb．fas＞ａｌign.out.
3、过滤。
⏹Identitｙ：
至少50％.
⏹Cｏver rｅｇion:
也要超过50%或者蛋白结构域的长度．
⏹domain:
必须要有完整的该蛋白家族的。
工具ｐfamdb （） 和ＮＣBI Batch CD- ｓearcｈ. （）．
⏹EST 支持
⏹ Bｌａｓt ａnｄ Hmmer同时检测到
４、通过上述操作获得某家族的所有成员
基因家族分析套路
（二）
本次主要讲解在基因家族分析类文章中，进化部分分析的内容。
主要是进化树的构建与分析。
一、构建进化树的基本步骤
１、多序列比对． Ｍusclｅ prograｍ.
2、Modeｌ 选择. 分别针对蛋白序列和核酸序列的模型选择程序。
PrｏtTｅst progｒam fｏr proteiｎ aｎd ModelTeｓｔ or Ｊmｏdｅtｌｅｓt fｏr ＤＮA（）.
3、算法选择。
三种． NJ, ML anｄ BI.
４、软件选择。
MEＧA （bｏoｔstrap ｌeaｓt 1０00 rｅpｌicates）， phyMＬ ａnｄ Mrbayｅｓ （）.
5、进化树修饰. MＥGA：
view－>optiｏｎs and ｓｕbtｒeｅ-> ｄraｗ options. Alｓo caｎ bｅ ｄecorａｔｅd ｉn ｗord （）
二、具体步骤
2.1 多序列比对。
一般采用musｃle。
因为 MUSＣLＥ ｉs onｅ of the beｓt－perforｍiｎg ｍultiple aliｇｎmｅnt proｇrams ａｃｃｏrｄinｇ to puｂｌished ｂeｎchmarｋ ｔｅｓts, wiｔh accｕrａcy and speｅd thａt are consistentｌｙ bettｅr than CＬUSTALW.
2．2 模型选择。
对于用蛋白序列构建进化树的可以采用下面命令：
jａｖa -Xmx250ｍ -ｃlaｓspath patｈ/ProｔＴｅst.jaｒ proｔtesｔ.PｒｏｔTeｓt -ｉ ａlignｍ.
运行结果如下图
ﻫ注意:
1）“．Pｈy” format. Oｎly alloｗ ten ｃhａraterｓ．注意名字不能重复相同。
2）AIC：
Akaikｅ Infｏrmatiｏn Criｔerioｎ framework.
3）Gamｍa distriｂuｔiｏn paramｅｔer （G）:
gamｍa shaｐe．
3）proportｉｏn of invａｒiaｂle sｉtes：
I．
２.3构建进化树
ﻫ
2.3.1 意义：
a聚类分析。
如亚家族分类。
像ＭＡＰＫKK基因家族通过进化树可以清楚分为 MEKK， Rａf ａｎd ZIK三个亚家族.
b亲缘关系鉴定。
在进化树上位于同一支的往往暗示这亲缘关系很近
c 基因家族复制分析。
研究基因家族复制事件（dupliｃａtｉｏn ｅvents），两种复制事件类型常采用的标准：
Ｔａｎdem dｕplicatｉoｎ:
Ideｎtｉty anｄ coveｒ reｇion ｍｏrｅ thａn 70％ aｎd tightly ｌinked （Hｏlub， 2001）.
Cｈｒomosomal ｓegment dｕplicatｉon:
Ｐlant Ｇenｏme Duplication Database （PGＤＤ:
）
2.3.2 进化树。
一般ＭL树比较准确，但应结合方法,如ＮＪ树，相互验证。
2.３．3 进化部分分析：
KａKs计算
2．3.3.1 简单的方法． 可以使用下面的网页PAL2NＡL（）
２.３.3.2 标准方法:
.
a. ＰaraAT：
ParａAT.pl－h tｅsｔ．homologｓ -n test.cds -a ｔeｓt．ｐep -p proc –f aｘt –ｋ -o output
b． ＫaKｓ_Cａlculaｔor –m ＮG（or else） -ｉ tesｔ.axｔ -ｏ teｓt．axｔ.kaks
c.分歧时间计算:
Divergｅnttime（T） caｌcｕlation.
Ｔ=Ks/2λ. λ ：
mｅａn 5.１-7.1×10－９ .
ｄ.Ｋａ／Ks意义：
Ka/Ｋｓ=1．中性进化。
．
Ｋa/Ks<>
Ka/Ks>1.正选择。
Pｏsiｔiｖelｙ ｓelected ｇenｅs and proｄucｅ fiｔｎeｓs advａntaｇemutatioｎｓ tｏ ｅｖolｖe ｎeｗ fｕnctｉoｎs.
基因家族分析套路（三）
本节主要讲基因结构分析套路
1、Motif分析
使用软件MEME，命令如下:
ｍｅme sａmpｌe.ｆa -ｄna –ｒｅvcomｐ -ｎｍoｔifs 10 -ｍｏd ｚooｐs －minｗ ６－ｍaxw ５0>memｅ_htｍlＦormat.ｈｔml
2、基因结构分布图
可以使用在线网站GＳDS2.0:
websｉｔｅ:
用法如下:
结果展示
３、基因结构常见统计信息:
自己eｘcel或写程序统计
ａ. Tｈe numｂｅｒ of introｎ anｄexon.
b． The splicing ｉntronpaｔteｒｎ inｃulding ０,1，２ phasｅ.
c. Thｅ markｅd rｅｇiｏn. Foｒexample kinase domaiｎ.
ｄ. sequeｎce lengtｈ．
e. UTR．
４、启动子分析。
网站:
主要做植物的：
ﻫ注意事项:
a. IE brower.
b. Only oｎe sequence ｆｏr oncｅsearcｈ ａnｄ the leｎgtｈ ｗas limiteｄ in 1000 bp.
c. DＮA sequｅnce orｉgin:
1０00 oｒ1500 bp upstｒeaｍ of ATＧ of ｏne gene.
分析结果：
基因家族分析套路（四）
一、转录组及芯片原始数据下载网站
１、 GEO daｔeｓets／pｒo ）.。
用法见下图。
ＧEO数据ID命名规则：
ＧPＬ－>GＳE->ＧSＭ.
GPL:
platｆorｍ
GSE:
ｍulｔiｐle ｓｅries.
ＧSM:
mｕltipｌe sａｍｐles.
ＧDS ≈ GSE． Ｔheｄiｆferｅnｃe concentｒateｄ on the data lａbeled GDS can bｅ analyzed ｆor ｏne geneoｎlｉne. Ｉt iｓ sｉmｐle and ｅａｓiｌy．
Tｈe dａｔa iｎ the samｅGＰL ｃａn ｂe used ｔo compare inexpｅrimenｔ
下面是在线分析转录组数据的用法:
２、ＥBI ArrayExprｅsｓ（）
该数据库下载数据用法如下:
3、PLＥXｄb（）．
该数据库下载数据用法如下,注意用户名和密码!
4、SRＡ dｂ（）
5、DRA db（）
二、数据处理
拿到原始数据，要进行处理，才能进行后续数据分析。
1、芯片数据。
原始数据格式“.cel”格式。
以AffyMicrｏarrａｙ数据处理为例讲述主要的命令如下：
> liｂrary（affy）;
>ｌｉｂrary（maｋecｄfeｎv）;
>libｒａry……
> ｂａｒleyＧｅｎome = make.cdf.eｎｖ（“ｂarleyGenｏｍe.cｄf"）
>mydａta <- RｅadAffy（） #＃ｃｈoose “.ｃeｌ “ .
>eseｔ <- ｒma（mｙｄａta）;
>wrｉte.exｐrs（eｓet，filｅ="ｍydata.txｔ"）
＞dｅｓiｇn ＜- ｍodeｌ.ｍａtrix（～-1＋factｏr（c（1，1,2，2,３,3））） # Createｓappropriate dｅsigｎ ｍatrix．
>coｌnamｅs（deｓign） <-ｃ（"gｒoｕｐ１＂, "ｇｒoｕｐ2", "grｏup3"） # Ａssigns cｏｌuｍｎ ｎaｍes．
>fiｔ <- lmＦit（ｅset, dｅｓign） # Fits a lineａｒ moｄel ｆｏr eａch ｇenｅ based ontｈe ｇivｅn seｒｉes of arraｙs．
>ｃonｔraｓt.ｍatrix <- makeＣontrasｔｓ（group2-gｒｏｕｐ1,grｏup３-group２, group3－ｇｒouｐ１, levels=deｓigｎ） # Cｒeatｅs appropriate contrａｓt maｔｒix toperfoｒm aｌl pairｗise comｐarｉsons.
＞fit2 <- cｏntrastｓ.fit（fit， cｏnｔrasｔ.matｒix）＃ Cｏｍｐuteｓ estimatedｃoeffiｃｉeｎtｓ aｎd sｔandａｒｄ ｅｒrors ｆor a given ｓet oｆ conｔrastｓ．
>fｉt2 <- eBayｅｓ（fｉｔ2） # Cｏmputｅs mｏderatｅｄ t-stａtiｓtｉcs and lｏg-ｏddsoｆ dｉｆｆerentｉal exprｅssion by emｐｉricaｌ Bayes
>tｏpTable（fｉt2, coeｆ=１,adjｕｓt＝＂fdr", sorｔ.by="B"， number=１０） ＃ Gｅneｒateｓ lｉsｔ ｏf ｔop 10 （＇numbｅr=１0'）diｆｆeｒeｎtiaｌlｙ ｅｘprｅsｓeｄ genes ｓorted by Ｂ-values （＇ｓｏrt．ｂy＝Ｂ'） ｆｏr fiｒstｃoｍpaｒisｏｎ ｇｒoｕp.
＞ｗｒite.taｂle（toｐTａｂle（fit2, coｅf=１,aｄjust=＂fｄr"， sort.by=＂B", number=500）,file="limma_coｍpleｔe．xlｓ", row．names＝Ｆ, sep＝"\t"） ＃ Exｐｏrts complete limma statiｓｔics table forfｉrst coｍpariｓon gｒoup．
＞results <- decideTeｓts（fｉt2,p．vａｌuｅ=0.05）; ｖennＤｉａgram（ｒesｕlts）
2、转录组数据处理。
原始数据格式为ｓra或fastq格式。
Sra可以转换为fａstｑ然后运用下面的命令进行处理。
1）获得ｃleandaｔa;
ｆaｓｔx＿clipｐer :
cｌiｐ ａｄaｐter.
ｆａstq_qｕaliｔy＿filter：
ｂａse qｕality coｎtroｌ.
fastｑ_ｑualiｔy_trimmer:
tｒim 5’ ｌoｗ qualiｔy bases.
２）计算ＲPKM.
boｗtie2-builｄｐatｈ／ｄb.seq paｔh／ｄｂ
ｔoｐhat db ｒeａd.fastq
ｂａm_ｆilteｒ pａｔｈ/acｃepteｄ_hits.bａm
samtooｌs vieｗ -h -o ouｔput-unｉq.saｍ ｏｕｔpｕｔ_uniq.bam
excel ｆoｒ calculation（ｌｏｗ frequeｎcyreads ≤5 ｗere omｉtted ）．
3）差异表达的基因。
寻找存在差异表达的家族成员，推测其可能的功能。
有下面两种分析策略,均可采用。
ａ.倍数法。
对于基因家族分析，可以采用倍数法,以2倍为标准,得到上调和小的基因
b.CV值。
计算某个成员在不同处理下的基因表达变化。
CV =SD/meａn.Ｕsｅd ｉn ｄiｆfeｒｅｎttissｕes oｒ orgaｎｓ aｎlysｉs.
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