质粒DNA测定实验报告.docx
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质粒DNA测定实验报告
实验名称
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
教师签名
批改日期
格式要求:
正文请统一用:
;数字、英文用TimesNewRoman;标题用:
黑体,加粗。
需强调的地方请用蓝颜色标出。
不得出现多行、多页空白现象。
一、实验目的
4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作
二、实验原理
1.PCR(多聚酶链式反响)
在DNA聚合酶催化下,可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外〔缓冲液中〕复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。
PCR一次循环的具体反响步骤为:
A.变性:
加热反响系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链。
B.退火:
逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温〔35-70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右〕,与模板DNA互补退火形成局部双链。
C.延伸:
溶液反响温度升至中温72℃,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。
2.质粒DNA的提取与制备
(1)碱裂解法:
染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异:
A.高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA均变性;
B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。
(2)离心层析柱:
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;
B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;C.低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯洁质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量分析〔紫外分光光度法〕:
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性;
B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰
蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰
碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰
C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度;
A260/A280=1.8DNA纯洁
A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质〔芳香族〕或酚类物质
A260/A280>1.8含RNA杂质,用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切鉴定:
限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的根本工具。
限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳:
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:
不同的DNA,分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).
三、:
以流程图示意
〔一〕实验材料:
1.PCR
仪器:
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管
材料:
菌液:
大肠杆菌DH5a菌株(含靶基因CHD5片段的pMD18-T)、无菌去离子水、2×PremixTaq、引物
2.质粒DNA的提取与制备
仪器:
恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管
材料:
溶液P1〔S1〕、溶液P2(S2〕、溶液P3〔S3〕、去蛋白液PE〔W1〕、漂洗液WB〔W2〕、洗脱液EB〔Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α
3.质粒DNA的定量〔紫外分光光度法〕
仪器:
比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪
材料:
蒸馏水、质粒DNA
4.质粒DNA的酶切鉴定
仪器:
1.5ml的EP管、微量加样枪
材料:
无菌水、10×M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)
5.琼脂糖凝胶电泳
仪器:
凝胶电泳系统、凝胶成像系统
Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液
(二)
1.实验流程:
简述实验内容流程,PCR操作步骤
↓
煮菌,PCR〔PCR程序最后设4℃保温〕
↓PCR仪运行约2小时
↓学习PCR原理、质粒DNA提取和酶切原理
质粒DNA提取〔约1小时〕
↓
酶切操作
↓保温约1~2小时
↓学习紫外检测定量原理、琼脂糖电泳原理
紫外检测定量
↓
电泳上样〔样品:
质粒DNA,PCR产物,酶切产物,Marker〕
↓电泳仪运行约30分钟
观察电泳结果、记录、拍照、保存
2.实验步骤
1〕PCR反响
①菌体煮沸10分钟,冷冻,室温下解冻后离心,取上清液。
②取PCR反响管,用加样枪参加以下各试剂。
试剂体积
灭菌去离子水4.5ul
2*PremixTap12.5ul
引物1-SO100(10mol/L)1.5ul
引物2-SO101(10mol/L)1.5ul
菌液5ul
总体积25ul
注意:
如配好的反响液较多沾到管壁上,可将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心,使反响液集中于管底,然后将反响管放到基因扩增仪(PCR仪)上。
③按照以下顺序操作PCR仪进行基因扩增
ⅰ、94℃预变性5分钟后开始以下循环;
ⅱ、94℃、30秒;
ⅲ、55℃、30秒;
ⅳ、72℃1分钟;
ⅴ、25个循环
ⅵ、72℃5分钟;
ⅶ、4℃保温。
实验过程约1小时30分钟.
2)质粒DNA提取与定量:
步骤
操作流程
①
取1.5ml培养物参加Eppendorf管中
②
13000rpm离心1min,弃上清液
③
参加250μl溶液S1,吹打,使细菌沉淀分散,彻底悬浮
④
参加250μl溶液S2,颠倒4~6次混匀〔不要剧烈振荡〕,直到溶液变得清亮
⑤
参加350μl溶液S3,立即温和混匀6~8次。
13000rpm离心10min,小心取上清液〔700μl〕。
⑥
将吸附柱放于收集管中,将上一步所得上清液参加吸附柱中,13000rpm离心3min,弃滤液。
⑦
参加500μl去蛋白液W1,13000rpm离心1min,弃滤液
⑧
向吸附柱中参加700μl漂洗液W2,13000rpm离心1min,弃滤液
⑨
重复步骤8一次
⑩
空柱13000rpm离心1min,然后开盖室温放置3min,使残留乙醇挥发
11
取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间加30μl洗脱缓冲液(Eluent),室温放置1min,13000rpm离心1min洗脱质粒DNA,保存备用。
紫外光吸收法定量检测
3)酶切鉴定
在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次参加下述试剂
试剂名称
体积(µl)
无菌水
9.0
10×M酶切缓冲液
2.0
质粒DNA
7.0(约500ng)
Hind III (15U/ul)
1.0
EcoR I (12U/ul)
1.0
总体积
20.0
移液枪轻轻混匀(防止产生气泡),37℃水浴1.5h
4)琼脂糖凝胶电泳
电压:
80~120V时间:
15~30分钟
考前须知:
1 倒胶时把握好胶的温度,不要高于60℃,否那么温度太高会使制板变形
2 胶一定要凝固好才能拔梳子,方向一定要竖直向上,不要弄坏点样孔
3 电泳前,确认样品孔位于电场负极;
4 点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡,缓冲液不要太多
5 Geldview有毒,切勿用手接触,更不要污染环境,胶勿乱扔
6 紫外线照射不要太久
上样
每组加3个样品孔,记住位置
第一孔:
9µl质粒DNA与1µl6×loadingbuffer混匀后上样
第二孔:
9µl酶切产物与1µl6×loadingbuffer混匀后上样
第三孔:
10µlPCR产物直接上样
四、结果与讨论:
①结果:
实验数据、现象、图谱;②讨论:
以结果为根底的逻辑推论,并得出结论。
(一)实验结果:
1.PCR反响:
溶液体系完成经过PCR扩增后,得到的PCR反响管内溶液呈绿色。
2.质粒DNA提取与定量:
培养物在EP管中呈白色,参加溶液S1后细菌沉淀分散,参加溶液S2混匀后溶液变得清亮,再参加溶液S3,管内出现白色絮状沉淀,加漂洗液W2后,经离心别离出无色透明的上清液与底层的白色沉淀。
紫外光吸收法定量检测
测量次数
质粒DNA浓度(μg/ml)
Ratio值(A260/A280)
①
87.0
1.73
②
81.1
1.81
③
78.2
1.78
平均值
82.1
1.77
3.酶切鉴定:
经酶切37℃水浴1.5h后得到无色透明溶液。
4.琼脂糖凝胶电泳:
我们小组是10、11、12
(二)讨论
1.A260/A280的比值可以反响DNA的纯度
A260/A280=1.6-1.9DNA样品较纯,符合实验要求
A260/A280<1.6有蛋白质或者其他杂质的污染
A260/A280>1.9RNA污染
本实验中A260/A280=1.77说明DNA样品根本较纯,符合实验要求。
2.琼脂糖凝胶电泳成像结果
经凝胶电泳后,从成像结果可观察到DNAMarker5000、质粒DNA、酶切产物与PCR产物与发生迁移并各自形成相应条带:
①PCR产物形成的条带大致位于500bp左右的位置。
②酶切产物条带可观察到位于3000bp左右位置的酶切长片段,并隐约可见处于500bp位置附近的酶切小片段。
酶切小片段成像不明显,原因可能是:
上样的时间过长,样本发生溶解扩散,使质粒量减少;点样时,等待时间过久,样品可能在凝胶中扩散;吹打液体时,局部液体可能因为过于剧烈而扩散。
③质粒DNA中出现三条带,分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。
这三种不同构型的分子有不同的迁移率,在一般情况下,迁移速度最快的为超螺旋型,其次为线性分子,最慢的为开环状分子,所以条带从下到上分别为:
超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。
其中线性质粒DNA的条带亮度最大,说明其含量最高;而超螺旋质粒DNA亮度较小,含量较低。
〔三〕思考题:
1.碱法提质粒中溶液I、II、III的作用?
答:
溶液I:
螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用;有利于溶酶体的作用。
溶液II:
细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和蛋白质变性。
溶液III:
酸性条件下质粒DNA复性,变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA。
2.结合实验情况,如何提高限制性酶切的反响效率?
答:
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反响体系的1/10体积,而且最大反响体系最好不要小于20ul,且酶切反响中甘油浓度应低于5%。
③保证底物DNA的纯度:
主要污染DNA的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。
④反响系统:
主要是反响缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,适宜离子强度可以激发酶切反响。