环工环境微生物实验.docx
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环工环境微生物实验
环境微生物实验注意事项
1、实验室
1）无菌室和超净工作台应定期打扫，使用前用紫外灯闭光（可见光）照射30分钟杀菌，每年视使用情况以甲醛熏蒸法对实验室彻底灭菌1~2次。
2）做微生物实验时，应有计划，统筹安排，减少进出无菌室的次数。
3）实验前应用肥皂或洗手液清洗双手，进无菌室后再用酒精棉球将双手彻底擦拭一遍。
4）不应将无关的物品带入无菌室。
5）爱护、正确使用实验仪器设备，尤其是电子天平、显微镜等精密仪器，高压灭菌锅、离心机等危险设备。
6）实验完毕后应关闭水电开关，熄灭酒精灯，检查无误后方可离开。
2、操作技术
1）本实验室为节省资源，所有灭菌均采用湿热灭菌法。
2）灭菌材料和器具如无特殊需要，应在121摄氏度，灭菌20分钟，灭过菌的材料和器具，一旦触及未经灭菌的东西或暴露在带菌的空气之中，即不能再视为无菌。
3）操作手法与微生物实验相同，实验人员应有专用实验服。
4）注意安全，轻拿轻放，不要打翻酒精灯造成烧伤；打碎玻璃仪器造成割伤，感染致病菌。
5）培养物和用过的玻璃仪器应严格灭菌后再进行清洗、干燥，以备下次使用。
6）实验人员应熟练无菌操作手法，既要保证实验结果又要注意自身安全。
无菌操作规范
培养基经高压灭菌后,用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料（如样品、菌苔或菌悬液等）于培养基上。
这个过程叫无菌接种操作。
1．实验台的条件
实验台面不论是什么材料，一律要求光滑、水平。
光滑是便于用消毒剂檫洗；水平是倒琼脂培养基时利于培养皿内平板的厚度保持一致。
在实验台上方，空气流动应缓慢，杂菌应尽量减少，其周围杂菌也越少越好。
为此，必须清扫室内，关闭实验室的门窗，并用消毒剂进行空气消毒处理，尽可能地减少杂菌的数量。
2．无菌操作的原理和方法
空气中的杂菌在气流小的情况下，随着灰尘落下，所以接种时，打开培养皿的时间应尽量短。
用于接种的器具必须经过干热或火焰等灭菌。
接种环进行火焰灭菌时，要充分烧红（接种柄，一边转动一边慢慢地来回通过火焰三次），冷却，先接触一下培养基，待接种环冷却到室温后，方可用它来挑取含菌材料或菌体，迅速地接种到新的培养基上。
然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过火焰灭菌，复原。
不要直接烧环，以免残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。
平板接种时，通常把平板的面倾斜，把培养皿的盖打开一小部分进行接种。
（1）先用左手拿菌种试管，再用右手拿1支斜面培养基试管，与菌种试管一起并于左手中。
两支试管的斜面都朝上，。
将左手托起，四指并拢伸直。
把菌种试管放于食指和中指之间，斜面培养基试管放于中指和无名指之间，拇指按住两支试管的底部。
（2）右手拿接种环，同握钢笔一样。
先垂直在火焰上将接种环部分烧红，接种时可能进入试管的柄部分也要烧灼，但不必烧红。
（3）将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手小指和手掌同时夹住两个棉塞，棉塞入口必须在手心外；也可用右手无名指和小指缝夹住前方菌种试管的棉塞，再用小指和手掌夹住后方斜面培养基试管的棉塞。
（4）拔掉两支试管的棉塞，立即在火焰上烧灼试管口。
烧灼时可将试管口适当转动，时间不要过长。
试管口如果沾有少量杂菌，经烧灼后大部分可被烧死，即使有少部分不死，也已经被加热固定于管口壁上。
（5）将烧灼过的接种环伸入菌种试管内，先将环接触没有菌苔的培养基部分，使其冷却，以免烫死被移种的菌体。
然后，轻轻接触菌苔，沾取少许菌体，慢慢将接种环移出试管，注意不要使沾有菌苔的环碰到管壁，取出后勿使环通过火焰。
（6）迅速将接种环伸入另一试管，先将沾有菌苔的接种环在斜面接触一下，使一部分菌体粘附在培养基上，再把环从斜面底端开始向上端轻轻画线（蜿蜒曲线或直线）。
注意不要平放，不要划破培养基，也不要使菌苔沾污到管壁。
（7）抽出接种环，将两支试管口同时在火焰上烧灼。
烧灼管口后，将右手中拿着的两个棉塞塞到试管口上。
注意不要用试管口去迎棉塞，以免试管在运动时进入空气造成污染。
（8）将环在火焰上再慢慢烧红灭菌。
放下接种环后，空出右手将棉塞塞妥。
然后竟已接种的斜面试管放在试管架上。
另取一支试管，按上方法继续接种，直至全部试管斜面接种完毕。
在实际操作中也可以单管斜面进行接种。
即先以左手拿菌种试管，右手拿接种环灭菌；用右手小指和手掌夹住菌种试管的棉塞，试管口通过火焰；用灭菌的接种环伸入菌种试管内挑取菌体，塞回棉塞，复原；再用左手取空白斜面，同上述用右手夹出棉塞接种操作。
在向培养皿内倒培养基或接种液时，试管口或瓶壁外面不要接触底皿边，试管口或瓶口应倾斜一下在火焰上通过。
显微镜的使用
1．显微镜的结构与性能
显微镜的结构分光学系统和机械系统两大部分。
光学系统包括物镜、聚光镜和反光镜、目镜，较好的显微镜还有光源。
机械系统包括镜座、镜臂、镜台、物镜转换器、镜筒及调节器等。
2．普通光学显微镜的光学原理
1．光学显微镜的成象原理
有外界入射的光线经反光镜反射向上，或由内光源发射的光线经集光镜向上，再经聚光镜会聚在被检标本上，使标本得到足够的照明，由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45度角的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实象，该实象经目镜的接目透镜放大成虚象，所以人们看到的是虚象。
2．显微镜的放大倍数
被检物体经显微镜的物镜和目镜放大后的总放大倍数是物镜的放大倍数和目镜的放大倍数的乘积。
如用放大40倍的物镜和放大10倍的目镜的总放大倍数是400倍。
3．工作距离
工作距离是指观察标本最清晰时，物镜透镜的下表面与标本之间（无盖玻片时）或与盖玻片之间的距离。
物镜的放大倍数越大，其工作距离越短，油镜的工作距离最短，约为0.2mm，所以使用油镜时，要求盖玻片的厚度为0.17mm。
虽然不同放大倍数的物镜工作距离不同，但生产厂家已进行校正，使不同放大倍数物镜转换时，只需进行细调焦便可使物象清晰。
3．低倍镜和高倍镜的使用
1．标本放置
下降镜台或升高镜筒，把标本置于镜台上，用载片夹夹牢。
2．调焦
转动粗调螺旋，升高镜台（或下降镜筒），使低倍物镜的前端接近载片，用左眼在目镜上观察，并转动粗调节螺旋，使镜台下降（或镜筒上升），可看到物象，然后转动细调节螺旋，使物象清晰。
3．换高倍镜
用低倍镜看到物象后，转动标本移动器上螺旋，选择合适的视野，并把要观察的部位置于视野的中央；转动物镜转换器把高倍镜置于镜筒下方。
显微镜在设计制造时，都是共焦点的，即低倍镜对焦后，转换高倍镜后一般都能对准焦点，能看到物象，只需转动细调节螺旋便可使物象清晰。
通过调节集光镜上视场光阑或照明度控制钮使获得最佳照明。
4．油镜的使用
由于细菌个体微小，需要用油镜进行观察。
1．滴加镜油
转动粗调节螺旋，使镜台下降或镜筒上升，在染色标本处滴加1~2滴液体石蜡或香柏油。
2．转换油镜
转动物镜转换器，把油镜置镜筒下方。
3．调焦
转动粗调节螺旋，使镜台上升或镜筒下降，让镜头的前端浸入镜油中。
操作时要从侧面仔细观察，只能让镜头浸入镜油中紧贴着标本而避免让镜头撞击载玻片，导致玻片和镜头损坏。
然后在目镜下进行观察，并缓慢地转动粗调节螺旋使镜台下降（或镜筒上升）即可看到物象，在转动细调节螺旋使物象清晰。
转动粗调节螺旋使镜台下降（或镜筒上升）时，若油镜已离开油滴，必须重新进行上述调焦操作。
不得边用左眼在目镜上观察，边转动粗调节螺旋使镜台上升（或镜筒下降）使镜头前端浸入油滴中，这样易使镜头撞击载玻片，损坏标本和镜头。
4．调节孔径光阑和视场光阑
把孔径光阑开到最大，使与油镜的数值口径相匹配。
通过调节视场光阑或照明度控制钮，选择合适的照明。
5．显微镜使用后的处置
转动粗调节螺旋，使镜台下降（或镜筒上升），取出染色标本玻片，然后先用檫镜纸檫去油镜上的香柏油，再用檫镜纸沾少许二甲苯（不能用酒精）檫去沾在油镜上的镜油，最后用檫镜纸檫净二甲苯及镜油。
用液体石蜡作镜油时，可以只用檫镜纸即可檫净，不必用（或仅用极少量）二甲苯。
把镜头转成“八”字形，套上镜罩后放入显微镜柜中。
革兰氏染色
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使细菌体着色，显示出细菌的一般形态结构及特殊结构，在显微镜下进行观察。
根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型即简单染色、鉴别染色和特殊染色。
这里主要介绍鉴别染色——革兰氏染色法。
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两大类。
1．革兰氏染色法原理
革兰氏染色法原理是利用细菌的细胞壁组分成分和结构的不同，革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。
而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被脱色，再经蕃红复染后细胞呈现红色。
2．革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用
（1）碱性染料：
草酸铵结晶紫液。
（2）媒染剂：
碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力，加强染料与细胞的结合。
（3）脱色剂：
乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。
利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。
（4）复染液：
蕃红溶液，目的是将已经脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色细菌进行比较。
3．染液及实验用品
染液：
草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液。
其他物品：
无菌水、显微镜、载片、滤纸、液体石蜡、擦镜纸、接种环。
4.革兰氏染色发步骤
（1）涂片
革兰氏阳性菌（如大肠杆菌）和革兰氏阴性菌（如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）的任何一种进行涂片。
取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴无菌水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体，与水混合，烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径约1cm的均匀薄层。
制片是染色的关键，载片要洁净，不得沾污油脂，菌体才能涂布均匀。
注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。
（2）干燥
涂布后，待其自然干燥。
（3）固定
将已干燥的涂片标本向上，在微火上通过3~4次进行固定。
固定的作用为：
a.杀死细菌；b.使菌体蛋白质凝固，菌体牢固黏附于载片上，染色时不被染液或水冲洗掉；c.增加菌体对染料的结合力，使涂片易着色。
（4）染色
在涂片处滴加草酸铵结晶紫1~2滴，使布满涂菌部分，染色1min，用水冲洗。
（5）媒染
滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，用水冲去碘液。
（6）乙醇脱色
斜置载片于一烧杯上，滴加95%乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约0.5分钟）。
立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。
脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。
若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。
（7）复染
蕃红染液复染1min，水洗。
（8）吸干并镜检
若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。
实验一天然水环境中原生动物及藻类的观察
目的：
学习原生动物和藻类的制片与观察方法，并识别几类常见的原生动物及藻类。
材料仪器：
显微镜、载玻片、盖玻片
方法：
1、采样采样地点应选择水藻丰富的天然水体，采样者用硬质玻璃瓶或聚乙烯瓶，采样前先将容器洗净，采样时用水样冲洗3次，再交水样采集于瓶中，取水体表层带有水华的水样或取水体边的活性污泥。
2、制片取一干净载玻片放在实验台上，以滴管吸取一滴样品，滴于载玻片正中，另取一盖玻片，以盖玻片一边接触载玻片左翼侧，将盖玻片向右平行拉动，当盖玻片底边接触到水滴时，放手，使盖玻片自然盖于载玻片上，否则易形成气泡，影响观察，以滤纸吸干盖玻片周围溢出的水。
3、将制好的片放在显微镜的载物台上，以10倍物镜观察。
4、将所看到的原生动物和藻类用铅笔画于图画纸上，细微结构可转成40倍物镜观察。
作业：
1、绘图一张
2、思考：
所采样水体是否被污染，污染程度如何？
实验二活性污泥中菌胶团及生物相的观察
目的、原理：
活性污泥和生物膜是生物法处理水的主体，污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。
因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质，还可借助于显微镜观察微生物的状况来判断水处理的运行状况，及时采取适当的对策，保证稳定运行，提高处理效果。
本实验学习观察生物相，初步分析生物处理池内运转方式与正常情况。
材料与仪器
显微镜
载玻片、盖玻片
活性污泥（或生物膜）样品
压片标本的制备
取活性污泥曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央（如混合液中污泥较少可待其沉淀后，取沉淀的活性污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀后进行观察）。
盖上盖玻片，即制成活性污泥压片标本。
（按实验一制片方法）
在制作生物膜标本时，可用镊子从填料上刮取一小块生物膜，用蒸馏水稀，制成菌液，以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同。
作业：
1、绘图一张，包括五种以上原生动物或藻类及名称放大倍数。
2、你认为处理池运转方式是怎样的？
是否正常？
实验四水中粪大肠菌群的检测——多管发酵法和滤膜法
目的：
在饮用水的微生物安全检测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。
本实验采用多管发酵法和滤膜法测量水中的大肠杆菌数，了解水质受粪便污染情况，及此检测的卫生学意义。
多管发酵法
原理
根据总大肠菌群具有的生物特性：
革兰氏阴性、无芽孢、杆状、发酵乳糖产酸产气等，以特别培养基可将其鉴定、分离。
仪器
显微镜
革兰氏染色所用器材
高压蒸汽灭菌器
恒温箱
试管、杜氏管、平皿、刻度吸管
培养基
1、乳糖蛋白胨培养液
蛋白胨10g
牛肉膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水1000ml
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调整pH为7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于有倒置杜氏管的试管中，以115摄氏度，灭菌20分钟，待冷却后备用。
2、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
按上述乳糖蛋白胨培养基浓缩三倍配置。
3、品红亚硫酸钠培养基
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾5g
琼脂15g
蒸馏水1000ml
无水亚硫酸钠5g左右
5%碱性品红乙醇溶液20ml
先将蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂加入1000ml蒸馏水加热溶解混匀，调整pH为7.2~7.4，以115摄氏度，灭菌20分钟；再将5%碱性品红乙醇溶液置于无菌三角瓶中，以灭菌亚硫酸钠溶液调至淡粉红色；再将此混合溶液倒入灭菌后的培养基中摇匀；分装入无菌平皿中，冷却待用。
4、伊红美蓝培养基
蛋白胨10g
乳糖10g
磷酸氢二钾2g
琼脂15g
蒸馏水1000ml
2%伊红水溶液20ml
0.5%美蓝水溶液13ml
先将蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、琼脂加入1000ml蒸馏水加热溶解混匀，调整pH为7.2~7.4，以115摄氏度，灭菌20分钟；再将已灭菌的2%伊红水溶液、0.5%美蓝水溶液倒入灭菌后的培养基中摇匀；分装入无菌平皿中，冷却待用。
步骤
1、于各装有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有杜氏管）各加入10ml水样，于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有杜氏管）各加入1ml水样，于各装有10ml乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有杜氏管）各加入0.1ml水样。
共计15管，三个稀释度。
2、经培养24小时后，将产酸产气及只产酸的发酵管分别接种于品红亚硫酸钠培养基或伊红美蓝培养基上，37摄氏度培养24小时，取如下菌落革兰氏染色、镜检。
品红亚硫酸钠培养基上的菌落
紫红色，具金属光泽的菌落
深红色，不带或略带金属光泽的菌落
淡红色，中心色教深的菌落
伊红美蓝培养基的菌落
深紫黑色，具金属光泽的菌落
紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落
淡紫红色，中心色教深的菌落
3、上述菌落经镜检为革兰氏阴性无芽孢者，再以该菌落的另一部分接种于乳糖蛋白胨培养液中复发酵。
根据证实有大肠菌群的阳性管数按下表查出每升水样中的总大肠菌群数
总大肠菌群（MPN）检数表
（总接种量55.5ml，5份10ml；5份1ml；5份0.1ml水样）
接种量，ml
每升水样中总大肠菌群近似数
接种量，ml
每升水样中总大肠菌群近似数
10
1
0.1
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5
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0
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5
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5
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170
5
5
1
350
5
4
2
220
5
5
2
540
5
4
3
280
5
5
3
920
5
4
4
350
5
5
4
1600
5
4
5
430
5
5
5
>1600
滤膜法
原理
滤膜是一种微孔薄膜，孔径0.45~0.65微米，能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养，直接计数滤膜上生长的典型大肠菌群菌落，算出
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