化妆品32种禁限用染料成分的检测方法和编制说明.docx
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化妆品32种禁限用染料成分的检测方法和编制说明
附件2：
化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法
1范围
本方法规定了测定染发类化妆品中32种禁限用染料成分（见附录A）的高效液相色谱法。
本方法适用于染发类化妆品中32种禁限用染料成分的含量测定。
本方法无法区分所涉及染料成分的游离态、硫酸盐和盐酸盐，化妆品中各种形态同时存在时，应换算成一种形态，以总量表示。
2原理
用无水乙醇+水=1+1的混合溶液提取染发类化妆品中的32中禁限用染料成分，用高效液相色谱仪进行分析，以保留时间和紫外吸收光谱定性，峰面积定量。
本方法中32种禁限用染料成分的检出限、定量下限及取0.5g样品时的检出浓度及最低定量浓度见表1。
表132种禁限用染料成分的检出限、检出浓度、定量下限、最低定量浓度
序号
附录A中编号
物质名称
检出限/µg
检出浓度/（µg/g）
定量下限/µg
最低定量浓度/（µg/g）
1
3
1,5-萘二酚
5.010-3
20
1.510-2
60
2
5
1-萘酚
3.010-3
12
1.010-2
40
3
8
2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl
8.010-3
32
2.510-2
100
4
10
2,6-二氨基吡啶
1.510-2
60
5.010-2
200
5
13
2,7-萘二酚
3.010-3
12
1.010-2
40
6
15
2-氨基-3-羟基吡啶
1.310-2
52
4.010-2
160
7
21
2-氯-p-苯二胺硫酸盐
1.510-2
60
5.010-2
200
8
24
2-甲基雷琐辛
1.310-2
52
4.010-2
160
9
25
2-硝基-p-苯二胺
5.010-3
20
1.510-2
60
10
31
4-氨基-2-羟基甲苯
6.510-3
26
2.010-2
80
11
32
4-氨基-3-硝基苯酚
6.510-3
26
2.010-2
80
12
33
4-氨基-m-甲酚
8.010-3
32
2.510-2
100
13
34
4-氯雷琐辛
5.010-3
20
1.510-2
60
14
36
4-硝基-o-苯二胺
1.510-2
60
5.010-2
200
15
40
6-氨基-m-甲酚
1.010-2
40
3.010-2
120
16
42
6-羟基吲哚
3.010-3
12
1.010-2
40
17
61
氢醌
3.010-3
12
1.010-2
40
18
67
m-氨基苯酚
6.510-3
26
2.010-2
80
19
70
m-苯二胺
8.010-3
32
2.510-2
100
20
72
N,N-双（2-羟乙基）-p-苯二胺硫酸盐
2.510-2
100
7.510-2
300
21
73
N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐
2.510-2
100
7.510-2
300
22
74
N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺hcl
2.010-2
80
6.010-2
240
23
78
N-苯基-p-苯二胺
2.510-3
10
8.010-3
32
24
81
o-氨基苯酚
6.510-3
26
2.010-2
80
25
83
p-氨基苯酚
6.510-3
26
2.010-2
80
26
85
苯基甲基吡唑啉酮
2.010-2
80
6.010-2
240
27
87
p-甲基氨基苯酚硫酸盐
1.010-2
40
3.010-2
120
28
88
p-苯二胺
1.210-2
48
3.510-2
140
29
91
间苯二酚
8.010-3
32
2.510-2
100
30
95
甲苯-2,5-二胺硫酸盐
2.010-2
80
6.010-2
240
31
96
甲苯-3,4-二胺
8.010-3
32
2.510-2
100
32
OPD
o-苯二胺
8.010-3
32
2.510-2
100
3试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为超纯水。
3.1无水乙醇。
3.2甲醇，色谱纯。
3.3乙腈，色谱纯。
3.4亚硫酸氢钠。
3.5磷酸溶液（1+9）：
吸取磷酸（ρ20=1.69g/mL）10mL，加水90mL。
3.6磷酸盐混合溶液：
称取十二水合磷酸氢二钠1.8g、磷酸二氢钾2.8g和庚烷磺酸钠（C7H15SO3Na）1.0g，用水稀释至1L，混匀，配制成含庚烷磺酸钠（1g/L）的磷酸盐缓冲液，加入磷酸溶液（3.5），调节pH至6.0左右，0.45µm微孔滤膜过滤。
3.7染料类化合物标准储备溶液（ρ（染料成分）=10g/L）：
称取染料对照品约100mg（精确至0.1mg）于10mL容量瓶中，以2g/L亚硫酸氢钠水溶液+无水乙醇（3.1）=1+1的混合溶液定容至10mL，配成约10g/L的单标溶液。
以下几种物质在上述溶剂中的溶解性较差，分别采取如下措施：
甲苯-2,5-二胺硫酸盐和2-氯-p-苯二胺硫酸盐2种物质直接用2g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用无水乙醇（3.1）定容；2-硝基-p-苯二胺和4-硝基-o-苯二胺需将称样量减至25mg，再用无水乙醇（3.1）定容，配成约2.5g/L的单标溶液。
储备液保存于0℃～4℃冰箱中，最多使用2天。
4仪器和设备
4.1高效液相色谱仪，具有二极管阵列检测器。
4.2pH计。
4.3超声波清洗器。
4.4离心机。
5分析步骤
5.1样品预处理
称取样品约0.5g（精确至1mg）于10mL具塞比色管中，加无水乙醇（3.1）+水=1+1的混合溶液至刻度，超声提取15min。
超声过程中，若水温高于40℃应停置降温，冷却后继续超声，直至样品溶液完全均一化。
浑浊溶液可取适量高速离心，取上清液经0.45µm微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液，并尽快测定。
5.2测定
5.2.1色谱参考条件
色谱柱：
SupelcoDISCOVERYRP-AMIDEC16柱（250mm×4.6mm，5µm）或等同柱；
色谱保护柱：
SupelcoDISCOVERYRP-AMIDEC16保护柱（20mm×4.0mm，5µm）或等同柱；
流动相1：
乙腈（3.3）+磷酸盐混合溶液（3.6）=10+90；
流动相2：
甲醇（3.2）+磷酸盐混合溶液（3.6）=10+90；
流动相3：
乙腈（3.3）+磷酸盐混合溶液（3.6）=40+60；
流量：
1.0mL/min；
检测器：
二极管阵列检测器；
检测波长：
280nm；
柱温：
25℃。
5.2.2校准曲线的制备
参照色谱图1~色谱图3，对32种禁限用染料成分进行分组，并根据分组情况，分别移取适量染料类化合物标准储备溶液（3.7）于10mL容量瓶中，用无水乙醇（3.1）稀释至刻度，配成500mg/L的混合标准溶液。
各取混合标准溶液适量，用无水乙醇（3.1）稀释，配成10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L共6个浓度的混合标准系列。
标准系列应于使用前配制。
取各标准系列5µL注入高效液相色谱仪，分别采用3种流动相进行分析，记录各色谱峰面积，绘制校准曲线。
32种禁限用染料成分在流动相1和流动相2中的保留时间参考附录B。
5.2.3样品测定
在设定色谱条件下，取待测溶液5µL注入高效液相色谱仪，分别采用3种流动相体系进行分析。
色谱图检出的物质，经与该物质对照品的保留时间和紫外光谱图比较确证后，根据峰面积，从校准曲线上查得相应组分的质量浓度。
若待测溶液中染料成分的质量浓度超过了校准曲线线性范围的上限，需对待测溶液进行适当稀释。
注：
实际操作过程中，可参考附录B中32种禁限用染料成分在流动相1和流动相2中的保留时间，并结合色谱分离情况和样品中染料成分的不同，对32种染料成分进行合理分组，使各染料成分获得完全分离。
6平行实验
按以上步骤，做两份样品的平行测定。
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两次测定值的算术平均值的10%。
7结果计算
DV
w（染料成分）=——————100
（1）
m106
式中：
w（染料成分）——染发类化妆品中染料成分的质量分数，%；
——从校准曲线上查得的待测样液中染料成分的质量浓度，mg/L；
V——样品定容体积，mL；
m——样品取样量，g；
D——稀释倍数（不稀释则取1）。
8回收率和精密度
32种禁限用染料成分的提取回收率在82%~115%之间，方法回收率在86%~114%之间，相对标准偏差在1.1%~9.9%之间。
9色谱图
图1第一组染料混合标准溶液色谱图，流动相1
1：
p-苯二胺；2：
p-氨基苯酚；3：
甲苯-2,5-二胺硫酸盐；4：
m-氨基苯酚；5：
o-苯二胺；6：
2-氯-p-苯二胺硫酸盐；7：
o-氨基苯酚；8：
间苯二酚；9：
2-硝基-p-苯二胺；10：
甲苯-3,4-二胺；11：
4-氨基-2-羟基甲苯；12：
2-甲基雷琐辛；13：
6-氨基-m-甲酚；14：
苯基甲基吡唑啉酮；15：
N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl；16：
4-氨基-3-硝基苯酚
图2第二组染料混合标准溶液色谱图，流动相2
1：
m-苯二胺；2：
2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl；3：
氢醌；4：
4-氨基-m-甲酚；5：
2-氨基-3-羟基吡啶；6：
N,N-双（2-羟乙基）-p-苯二胺硫酸盐；7：
p-甲基氨基苯酚硫酸盐；8：
4-硝基-o-苯二胺；9：
2,6-二氨基吡啶；10：
N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐
图3第三组染料混合标准溶液色谱图，流动相3
1：
N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl；2：
苯基甲基吡唑啉酮；3：
6-羟基吲哚；4：
4-氯雷琐辛；5：
2,7-萘二酚；6：
N-苯基-p-苯二胺；7：
1,5-萘二酚；8：
1-萘酚
附录A
32种禁限用染料成分信息表
编号
INCI名
中文名称
3
1,5-Naphthalenediol
1,5-萘二酚
5
1-Naphthol
1-萘酚
8
2,4-DiaminophenoxyethanolHCl
2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl
10
2,6-diaminopyridine
2,6-二氨基吡啶
13
2,7-Naphthalenediol
2,7-萘二酚
15
2-amino-3-hydroxypyridine
2-氨基-3-羟基吡啶
21
2-Chloro-p-phenylenediaminesulfate
2-氯-p-苯二胺硫酸盐
24
2-Methylresorcinol
2-甲基雷琐辛
25
2-Nitro-p-phenylenediamine
2-硝基-p-苯二胺
31
4-Amino-2-hydroxytoluene
4-氨基-2-羟基甲苯
32
4-Amino-3-nitrophenol
4-氨基-3-硝基苯酚
33
4-Amino-m-cresol
4-氨基-m-甲酚
34
4-Chlororesorcinol
4-氯雷琐辛
36
4-Nitro-o-phenylenediamine
4-硝基-o-苯二胺
40
6-Amino-m-cresol
6-氨基-m-甲酚
42
6-Hydroxyindole
6-羟基吲哚
61
Hydroquinone
氢醌
67
m-Aminophenol
m-氨基苯酚
70
m-Phenylenediamine
m-苯二胺
72
N,N-Bis（2-hydroxyethyl）-p-phenylenediaminesulfate
N,N-双（2-羟乙基）-p-苯二胺硫酸盐
73
N,n-Diethyl-p-phenylenediaminesulfate
N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐
74
N,n-Diethyltoluene-2,5-diamineHCl
N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl
78
N-Phenyl-p-phenylenediamine
N-苯基-p-苯二胺
81
o-Aminophenol
o-氨基苯酚
83
p-Aminophenol
p-氨基苯酚
85
Phenylmethylpyrazolone
苯基甲基吡唑啉酮
87
p-Methylaminophenolsulfate
p-甲基氨基苯酚硫酸盐
88
p-Phenylenediamine
p-苯二胺
91
Resorcinol
间苯二酚
95
Toluene-2,5-diaminesulfate
甲苯-2,5-二胺硫酸盐
96
Toluene-3,4-diamine
甲苯-3,4-二胺
OPD
o-Phenylenediamine
o-苯二胺
附录B
32种禁限用染料成分在流动相1和流动相2中的保留时间参考数据表
出峰顺序
附录A中编号
物质名称
保留时间/min
流动相1
流动相2
1
88
p-苯二胺
5.049
6.163
2
8
2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl
5.084
7.176
3
70
m-苯二胺
5.244
5.681
4
83
p-氨基苯酚
5.587
7.133
5
15
2-氨基-3-羟基吡啶
6.396
11.125
6
95
甲苯-2,5-二胺硫酸盐
6.440
8.750
7
72
N,N-双（2-羟乙基）-p-苯二胺硫酸盐
6.722
12.067
8
67
m-氨基苯酚
6.787
7.456
9
33
4-氨基-m-甲酚
7.34
10.037
10
61
氢醌
7.338
8.639
11
OPD
o-苯二胺
7.409
8.156
12
21
2-氯-p-苯二胺硫酸盐
8.619
10.076
13
81
o-氨基苯酚
9.345
10.556
14
87
p-甲基氨基苯酚硫酸盐
9.549
14.931
15
10
2,6-二氨基吡啶
10.724
23.23
16
91
间苯二酚
11.165
13.336
17
25
2-硝基-p-苯二胺
11.527
13.290
18
96
甲苯-3,4-二胺
14.245
18.765
19
31
4-氨基-2-羟基甲苯
14.863
20.542
20
24
2-甲基雷琐辛
16.582
19.765
21
73
N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐
16.775
34.277
22
40
6-氨基-m-甲酚
18.596
26.696
23
36
4-硝基-o-苯二胺
19.977
22.054
24
85
苯基甲基吡唑啉酮
22.176
33.794
25
74
N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl
26.438
>50
26
32
4-氨基-3-硝基苯酚
26.807
34.854
27
42
6-羟基吲哚
35.056
43.504
28
34
4-氯雷琐辛
48.193
>50
29
13
2,7-萘二酚
>50
>50
30
78
N-苯基-p-苯二胺
>50
>50
31
3
1,5-萘二酚
>50
>50
32
5
1-萘酚
>50
>50
化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法编制说明
1任务来源
受国家食品药品监督管理局保健食品化妆品监管司委托，根据食药监许函[2011]126号《关于委托组织开展化妆品中m-苯二胺等八种禁用物质或限用物质检测方法标准研究的函》和食药监许函[2011]262号《关于委托开展化妆品中24种染发剂的检测方法研究的函》，开展化妆品中32种禁限用染料成分检测方法研究，建立染发类化妆品中多种染料成分的快速、准确、灵敏的色谱检测方法。
2研究背景
染发作为美容方式之一，已经成为一种世界流行的时尚。
在英国，染发剂的消费增长率已经连续8年高居生活必需品之首。
染发剂可分为氧化型（永久性）染发剂、直接型（暂时性或半永久性）染发剂、金属盐类染发剂、天然植物型染发剂等。
其中的氧化型染发剂以其染色效果好、维持时间长等诸多优点在欧洲和美国占到市场分额的80%。
染发剂中的染料成分多属于芳香胺类化合物，芳香胺中有很多物质具有致癌性，所以染发剂的安全性一直受到人们的极大关注。
在我国，消费人群也不断扩大，由于大面积使用染发剂的时间并不长，目前染发剂引起的各种健康问题并没有引起人们的足够重视，但是染发人群出现低龄化，意味着人们染发的时间可能越来越长，而染发剂的各种隐性危害很可能在今后几年内突出地显现出来。
由染发剂引起的过敏反应非常普遍，长期使用还可能致畸、致突变及引起内分泌效应等。
鉴于染发剂存在的各种安全问题及数目庞大的接触者和使用者，加强对染发剂的卫生管理和日常监督非常必要。
鉴于染发剂存在的各种安全隐患，我国《化妆品卫生规范》（2007年版）规定了93种暂时允许使用的染发剂，并明确了化妆品中最大允许使用浓度和各种限制条件。
但是，目前只能对8种染料成分进行检测，覆盖率不到1%。
因此急需建立化妆品中更多染料成分的检测方法，以满足监督检测的需求。
3研究现状
针对种类繁多的染料成分，各国科学家一直积极地研究新方法以适应不断增加的新型染发剂的检测要求。
由于氧化型染发剂所占的份额最大，研究人员将重点放在这一领域，只有少数文献报道了直接型染发剂的检测方法研究。
文献中报道使用的仪器种类很多，有薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱－质谱联用技术（HPLC/MS）、气相色谱（GC）、气相色谱－质谱联用技术（GC/MS）、毛细管电泳（CE）等。
在我国，《化妆品卫生规范》（2007年版）中列出了93种染发剂原料名单，但只推荐了其中8种染料成分的检测方法，存在着大量的检测空白，急需建立相应的方法。
根据染料的结构及性质，液相色谱是比较合适的检测手段。
本项目拟采用高效液相色谱法，开展化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法研究，建立染发剂中多种染料成分的快速、准确、灵敏的色谱检测方法，为卫生监管提供良好的技术支持。
4项目完成情况
根据食药监许函[2011]126号《关于委托组织开展化妆品中m-苯二胺等八种禁用物质或限用物质检测方法标准研究的函》和《开展化妆品中m-苯二胺等8种禁限用染料成分检测方法标准研究》项目委托协议书的要求，按期完成8种禁限用染料成分的检测方法，并按食药监许函[2011]262号《关于委托开展化妆品中24种染发剂的检测方法研究的函》的要求，同时提交另外24种染料成分的检测方法，具体情况如下：
（1）建立了化妆品中32种禁限用染料成分的高效液相色谱检测方法。
本项目中32种禁限用染料成分的方法检出限小于100µg/g，提取回收率在82%～115%之间，方法回收率在86%～114%之间，相对标准偏差在1.1%~9.9%之间，在5mg/L～500mg/L的浓度范围内线性关系良好（r>0.998），基本满足分析检测要求。
（2）本方法负责起草单位为中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，参与验证单位分别是北京市疾病预防控制中心、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防控制中心和山东省疾病预防控制中心。
本方法主要起草人为朱英、朱会卷、杨艳伟，参加起草人为吴大南、鲁琳、李金花、李蔚、钟志雄、张昀、陈金东、聂鲲。
验证结果满足《化妆品及其原料中禁限用物质检测方法验证技术规范》相关要求。
5方法概述
5.1仪器
Agilent公司Agilent1100高效液相色谱仪。
超声波清洗器。
离心机。
5.2试剂
染料标准品：
p-苯二胺、p-氨基苯酚、甲苯-2,5-二胺硫酸盐、m-氨基苯酚、o-苯二胺、2-氯-p-苯二胺硫酸盐、o-氨基苯酚、间苯二酚、2-硝基-p-苯二胺、甲苯-3,4-二胺、4-氨基-2-羟基甲苯、2-甲基雷锁辛、6-氨基-m-甲酚、苯基甲基吡唑啉酮、N,N-二乙基甲苯-2,5-二胺HCl、4-氨基-3-硝基苯酚、6-羟基吲哚、4-氯雷琐辛、2,7-萘二酚、1,5-萘二酚、N-苯基-p-苯二胺、1-萘酚、m-苯二胺、氢醌、4-氨基-m-甲酚、2-氨基-3-羟基吡啶、N,N-双（2-羟乙基）-p-苯二胺硫酸盐、p-甲基氨基苯酚硫酸盐、2,6-二氨基吡啶、4-硝基-o-苯二胺、N,N-二乙基-p-苯二胺硫酸盐、2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl共32种染料对照品（除2,4-二氨基苯氧基乙醇HCl由化妆品公司提供外，其余31种均购于美国sigma公司和日本东京化成公司，纯度≥95%）；无水乙醇、磷酸、氨水、亚硫酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾为分析纯，均购于北京化学试剂公司；乙腈和甲醇为色谱纯，购于Fisher公司；庚烷磺酸钠为色谱纯，购于美国Technologies公司。
5.3方法
5.3.1色谱条件
色谱柱：
SupelcoDISCOVERYRP-AMIDEC16柱，250mm×4.6mm，5µm。
色谱保护柱：
SupelcoDISCOVERYRP-AMIDEC16保护柱，20mm×4.0mm，5µm。
磷酸盐混合溶液：
称取十二水合磷酸氢二钠1.8g、磷酸二氢钾2.8g和庚烷磺酸钠（C7H15SO3Na）1.0g，用水稀释至1L，混匀，配制成含庚烷磺酸钠（1g/L）的磷酸盐缓冲液，加入磷酸溶液（1+9）调节pH至6.0左右，0.45µm微孔滤膜过滤，作为磷酸盐体系。
流动相1：
乙腈+磷酸盐混合溶液=10+90；流动相2：
甲醇+磷酸盐混合溶液=10+90，流动相3：
乙腈+磷酸盐混合溶液=40+60。
流量：
1.0mL/min。
检测器：
二极管阵列检测器，检测波长为280nm。
柱温：
25℃。
5.3.2标准溶液的配制
染料成分标准储备溶液（ρ（染料组分）=10g/L）：
称取染料对照品约100mg（精确至0.1mg）于10mL容量瓶中，以2g/L亚硫酸氢钠水溶液+无水乙醇=1+1的混合溶液定容至10mL，配成约10g/L的单标溶液。
以下几种物质在上述溶剂中的溶解性较差，分别采取如下措施：
甲苯-2,5-二胺硫酸盐和2-氯-p-苯二胺硫酸盐2种物质直接用2g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺直接用无水乙醇定容；2-硝基-p-苯二胺和4-硝基-o-苯二胺需将称样量减至25mg，再用无水乙醇定容，配成约2.5g/L的单标溶液。
储备溶液保存于4℃冰箱中，最多使用2天。
根据实际情况进行分组后，分别移取染料标准储备溶液于10mL容量瓶中，再用无水乙醇稀释至刻度，配成500mg/L的混合标准溶液。
各取适量混合标准溶液，用无水乙醇稀释成5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L共6个浓度的混合标准系列。
标准系列应于使用前配制。
取各标准系列5µL注入高效液相色谱仪，记录各色谱峰面积，绘
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