流式细胞术ppt课件.pptx

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流式细胞术-原理、操作及应用,1,主要内容,一、流式细胞仪结构和原理流式细胞术简介流式细胞仪的光信号检测流式细胞仪的结构组成荧光抗体的选择流式细胞术数据的存贮、显示与分析二、流式细胞术操作与技巧三、流式细胞术在生物医学中的应用,2,1.1流式细胞术简介,流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞（或生物学颗粒）的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。

流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。

3,流式细胞术的特点,检测对象：

单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：

多参数；检测特点：

单细胞水平分析；检测速度：

高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：

精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；,4,流式细胞仪的分类,分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。

分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选。

5,流式细胞仪的发展及商品化,1934Moldavanl:

Firsttry（固定式细胞分析-流动式）；1953Crosland-Taylor:

鞘流系统（解决难题）；1956Coulter原理（血细胞计数器）；1965Kamentsky:

分光光度计定量细胞成分和散射光应用；1967Kamentsky等设计了细胞分选的装置；1969Vandilla等:

第一台荧光检测细胞计（鞘流聚焦、激光）；1972斯坦福大学:

研制出荧光激活细胞分选仪（FACS）；1973BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流式细胞仪-FACS。

1975Kohler和Milstein:

单克隆抗体技术（促进流式发展）。

6,BD公司分析型流式细胞仪,FACSCalibur双激光四色，市场覆盖率最高,LSRII双激光六色，三激光八色，四激光十色，分析型最高配,FACSCantoII双激光六色，三激光八色,FACSVerse双激光六色，三激光八色,7,BD公司分选型流式细胞仪,FACSVantageSE,FACSAriaIII,Influx,8,1.2流式细胞术光信号检测,光信号的类型散射光信号：

与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。

前向散射光（forwardscatter,FSC）;侧向散射光（sidescatter,SSC）.荧光信号自发荧光（细胞色素因子、核黄素）：

微弱特异荧光：

标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。

9,1.2.1散射光信号,

（一）前向散射光FSCFSC信号方向与激光束平行，偏离度一般在1-6度范围内，亦称小角度散射光，主要反映被测细胞的体积大小和活力。

10,

（二）侧向散射光SSC,SSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。

11,（三）散射光的作用,实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。

粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,红细胞、死细胞和碎片,12,死细胞或碎片,粘连细胞,肿瘤细胞株FSC/SSC散点图,死细胞,加药处理后FSC/SSC散点图,通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。

13,1.2.2荧光信号,

（一）荧光：

物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。

发射波长（荧光波长）Emissionwavelength,激发波长Excitationwavelength,14,

（二）常用荧光素,499nm蓝色荧光（Blue）；500-549nm，绿色荧光（Green）；550-584nm，黄色荧光（Yellow）；585-615nm，橙色荧光（Orange）；616-700nm，红色荧光（Red）；700nm，远红外荧光（Far-Red）。

标记抗体的荧光素,15,核酸荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。

常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。

7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。

DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。

变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。

Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。

能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。

PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。

AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。

16,1.3流式细胞仪的结构组成,液流系统流动室液流驱动系统光学系统激发光源光束收集系统电子系统光电转换器数据处理系统细胞分选系统喷嘴电偏转板样本收集器,17,1.3.1液流系统,鞘流技术：

根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液（sheath）。

流体动力学聚焦：

稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。

鞘液,鞘液,细胞流,激光照射点,流体动力学聚焦示意图,18,1.3.2光学系统,

（一）激发光源：

激光器气体激光器：

氩离子（488nm、355nm）、氦氖（633nm）、氪离子（647nm）、氪氩（568nm）；染料激光器：

如氩离子激光泵浦的Rhodomin6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光；半导体激光器：

价格低、结构简单、寿命长。

BD的FACSCalibur已采用635nm半导体激光器。

激光特点：

单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。

现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、633nm和355nm、405nmUV；,19,

（二）光收集系统,滤光片的组成长通滤片（LP）：

只允许特定波长以上的光束通过；短通滤片（SP）：

只允许特定波长以下的光束通过；带通滤片（BP）：

只允许一定波长范围内的光束通过。

20,全反射光路,FACSAria流式细胞仪器信号检测系统,PE-Cy7,PerCP-Cy5.5,PE-TexasRed,PE,FITC,SSC,21,1.3.3电子系统,光电检测器将光信号转换成电子信号。

前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。

模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。

数据处理系统计算机系统数据采集、分析。

22,

（一）光电检测器（photodetector）,光电二极管（photodiode）光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管（photomultiplier,PMT）光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4）。

23,

（二）电信号两种放大方式,由于光信号比较弱，需将其等比例放大，方便计算机分析处理，一般信号的放大可以使用线性或对数两种方式。

线性（linear;lin）对数（logarithmic;log）一般FSC和SSC变异范围较小，故使用线性放大；荧光信号变异范围较大，多使用对数放大。

24,（三）荧光信号的面积A、宽度W和高度H,细胞通过激光检测区域时，产生的荧光信号被光电倍增管接收，形成脉冲信号。

荧光信号脉冲形成示意图,25,荧光信号脉冲的面积、高度和宽度,Width=Area/Height,一个信号脉冲有高度、面积和宽度。

26,27,通道（channel）一个光电检测器就是一个通道，有多少个光电二极管/倍增管，就有多少个通道：

散射光通道:

FSC通道和SSC通道；荧光通道通道命名方式：

以FL（fluorescence）加数字命名，如FL1、FL2、FL3等。

以该通道接收的主要荧光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。

Forexample：

FACSCalibur有488nm和633nm两根激光器，488nm能检测FSC、SSC、FL1（FITC）、FL2（PE）、FL3（PerCP），635能检测FL4（APC），代表Calibur有6个通道，最多能同时检测4个荧光，6种参数。

28,1.3.4流式分选,电荷式分选超声振动器（15-100kHz）液流充电系统高压偏转板收集装置（流式管、培养板）,lasers,断裂点（充电）,高压偏转板,29,四路分选原理,电荷式分选装置,30,分选指标,分选时间由三方面决定：

进样速度、目标细胞所占比例、需要收集的细胞数。

分选时间表（机器流速10000个/s时）,31,分选速度、分选纯度和分选收获率，相互影响。

分选纯度指被分选出来的细胞所占的百分比，一般能达99%以上。

分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。

分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率降低，反之亦然。

富集模式（enrichmode）纯化模式（purifymode）单细胞模式（singlecellmode）,32,1.4荧光抗体的选择,A根据流式细胞仪选择抗体流式细胞仪能检测的通道数（由激光器种类、数量和使用的光学滤片决定）。

如FACSCalibur：

多色标记荧光素搭配原则：

每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

FACSCalibur常用四色搭配：

FITC、PE、PerCP、APC。

33,B根据抗原表达强弱合理选择抗体不同的荧光素强度有所不同；高表达的抗原可用不太“亮”的染料，更“亮”的荧光素分配给表达低的抗原：

CD4-FITC、CD25-APC、Foxp3-PE,C选择荧光波谱间光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调节补偿。

CD5,34,1.5FCM数据存储、显示与分析,标准的FCM数据采用列表模式（listmode），记录了每个细胞的所有参数的信息。

每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为510000（字或双字）。

35,FCM数据显示方式,单参数直方图（Histogram）双参数数据显示：

散点图（DotPlot）伪彩图（Pseudo-colorPlot）等高线图（ContourPlot）密度图（DensityPlot）假三维图（Pseudo3DPlot）三维图（3DPlot）,常用分析软件CellQuestDivaFlowJOWinMDIFCSExpress,36,直方图Histogram,细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。

Counts,FITC荧光强度,37,横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。

DNA倍体分析,抗原表达分析,Overlay图,38,散点图,散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。

39,散点图和伪彩图,40,等高图和密度图,等高图：

类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。

密度图：

点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。

41,假三维图和三维图,42,设门与数据分析,门（Gate，简写G）是流式细胞术中的一个重要术语，FCM数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。

椭圆形,圆形,43,矩形,任意形状,R（Region，区域）。

门可以是单一区域（G=R1），也可以是几个区域组合在一起：

G=R1andR2;G=R1orR2;G=R1notR2。

44,十字门,线性门,45,二、流式细胞术操作与技巧,流式细胞术操作流