《PCR扩增过程中污染的预防与对策》.docx

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《PCR扩增过程中污染的预防与对策》

《PCR扩增过程中污染的预防与对策》

第一篇。

pcr扩增过程中污染的预防与对策pcr技术是聚合酶链反应，该技术可将极微量的靶dna特异的扩增上百万倍，从而大大提高对dna分子的分析和检测能力。

pcr反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，操作复杂，所以在其操作过程中常有污染发生，即使极少量的污染也会造成假阳性，稍有差错就会出现假阴性。

本文讨论pcr扩增过程中污染的预防与对策。

操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性、假阴性结果的产生。

污染的原因调查

标本间的污染；采集标本的容器被污染；提取过程中加样枪污染；试剂的污染；提取过程中气溶胶的污染等。

防止污染的预防与对策

实验人员要熟练掌握pcr操作技术，严格规范操作程序，操作过程中加样枪的使用，手套、枪头、离心管应一次性使用。

严格按试剂生产厂家提供的程序进行操作。

严把质量关，在操作当中总结，马上到期的试剂或刚过期试剂对pcr结果影响很大。

设立阴性质控和阳性质控。

阴性质控以监测试剂是否污染，阳性质控以监测pcr反应是否成功，产物大小是否合本理论要求。

实验室设置及设备的规范化

实验室划分为4区。

试剂准备区、，标本准备区、pcr循环扩增区、检测区。

扩增仪的设置要符合要求，取样器刻度准确，减少pcr循环次数，只要pcr产物过剩检测水。

近年来pcr技术已普及到各基层医院，广泛地用于感染性病原体，如hbvhcv的临床检测，由于缺乏对核酸扩增检验技术完整的了解以及缺乏质量保证措施，导致部分实验室结果出现假阳性、假阴性的出现，所以操作者必须熟练掌握技术，严格按操作规程操作，防止假阳性，假阴性结果的产生。

第二篇：

临床中pcr扩增的实验室设计临床基因扩增（pcr）实验室设计

介绍了什么叫做基因扩增实验室以及基因扩增实验室是如何保证实验结果的安全性和可靠性的。

并从平面布置、通风空调系统设计、污染的预防与控制几个方面探讨了基因扩增实验室设计的主要特点和应注意的问题。

★概述

临床基因扩增实验又称pcr实验，是专门用来检验艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一种检测手段。

它可以通过将病毒体内所含的基因进行扩增的方法，测出一些病毒含量不高的感染者体内是否含有特定的病毒。

由于该检测方法可以测出普通检验难以检测出的病毒并具有灵敏度高、特异性高、快捷、对样品要求低等优点，因此被临床医生广为认可，已广泛应用于医院的临床诊断和各防疫检测部门的禽疫病诊断。

但是，这种实验需要有能保证绝对安全、配置合理的实验室和非常规范的操作为前提。

近年来对临床基因扩增检验实验室的建设越来越得到重视，因为它对检测结果的可靠性、准确性和安全性起到至关重要的作用。

本文主要从临床基因扩增检验实验室的平面布局，空调通风系统设计、气流控制和污染的防制几个方面对实验室设计中的主要特点进行了阐述。

临床基因扩增检验实验室设计的核心问题是如何避免污染。

因此，实验室的平面布局、空调通风系统设计、气流控制等都是围绕这个核心问题进行的。

下面就对这几个方面分别进说明。

pcr实验室平面布局

临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域。

试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区、扩增产物分析区。

为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。

各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。

实验室通风空调系统设计及压力控制

pcr实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。

同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。

1.试剂贮存和准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。

试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。

对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。

2.标本制备区

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸（rna、dna）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定rna时cdna的合成。

本区的压力梯度要求为：

相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。

另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

3.扩增反应混合物配制和扩增区

该区域主要进行的操作为dna或cdna扩增。

此外，已制备的dna模板和合成的cdna（来自样本制备区）的加入和主反应混合液（来自试剂贮存和制备区）制备成反应混合液等也可在本区内进行。

在巢式pcr测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

本区的压力梯度要求为：

相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。

为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。

个别操作如加样等应在超净台内进行。

4.扩增产物分析区

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。

如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。

本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：

相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。

污染的预防与控制

pcr实验室设计的核心问题是如何避免污染。

在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：

扩增产物的污染；天然基因组dna的污染；试剂的污染以及标本间的污染。

由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。

所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。

因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。

1.工作区域的严格划分

（1）各个实验区域设置合理；

（2）各个实验区域要有明显的标记（如，醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

2.合理的系统设置

（1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统；

（2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。

3.规范的操作

（1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作；

（2）在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。

此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施；

（3）清洁工作及时、正确。

实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。

除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。

4.严格的管理

（1）严格控制进出实验室的人员。

与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门；

（2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如，不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域；

（3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。

（4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等；

（5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。

5.完备的实验室配套设施

完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如，超净工作台、离心机、加样器等。

第三篇：

临床基因扩增pcr实验室质量手册的书写临床基因扩增pcr实验室质量手册的书写

许

斌

（江苏省临床检验中心）

1质量管理的历史

1950年代临床实验室开始质量控制（qualitycontrol，qc）;xx年代参照工业的gmp管理思路建立良好实验室实践准则（goodlaboratorypractice，glp）；进入质量保证（qualityassurance，qa）；xx年代实验室引入质量体系认证及实验室认可制度，实现全面质量管理（tqm，totalqualitymanagement）。

质量体系认证——iso9000（xx版）；实验室认可——iso/iec标准17025-xx《校准和检测实验室资格的通用要求》；iso/dis标准15189-xx“医学实验室的质量管理。

”

2美国临床实验室认证

•发证机构：

hcfa（healthgarefinancingadministrations），卫生保健署•认证依据，cloa38，行业认可，强制，体系+能力•认证中介机构：

xjcaho（jointmissiononaccreditationofhealthcareorganizations）卫生机构认可联合委员会

xcap（collegeofamericanpathologist）美国病理家学会

xcola（missiononofficelaboratoryaccred-itation）

医生实验室认可委员会

3我国实验室合格评定

•认可

x依据：

iso/iec17025，15189x国家评审，自愿，体系+能力•认证

x依据：

iso9000：

xx版x中介机构，自愿，体系•行业技术验收

x《临床实验室管理办法》，《江苏省医院检验科建设与管理规范》x省、市临床检验中心，强制，体系+能力4pcr验收意义及验收依据

xx年开始的pcr实验室验收工作开创临床检验技术准入的先河、推动临床实验室标准化建设、规范检测市场、建立医疗事故预防机制。

其依据为：

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》卫医发[xx]10号《临床基因扩增检验实验室工作规范》卫检字[xx]8号《关于成立临床基因扩增检验专家组的通知》苏卫医[xx]42号

5规定应具有的sop（13个）

仪器设备的维护保养程序、仪器设备的校准程序、仪器设备的操作程序、临床标本收集程序、临床标本的处理（核酸纯化）程序、临床标本的保存程序、试剂的质检操作程序、消耗品购置验收和储存程序、废弃物的处理程序、内务管理程序、室内质量控制程序、核酸扩增及产物分析检测的操作程序、抱怨处理程序。

6质量管理体系

6.1定义在质量方面指挥和控制组织的管理体系。

（qualitymanagementsystem）管理体系是指建立方针和目标并实现这些目标的体系。

实验室通过把组织机构、职责、工作程序、质量活动过程和各类资源、信息等协调统一起来所形成的有机整体即为实验室的质量体系。

6.2质量体系的文件构成第一层：

质量手册（纲领性文件）；第二层：

程序性文件（体系要素的规定）；第三层：

作业指导书（具体项目的操作指导）；第四层：

记录包括表格、签名、原始记录、报告等质量记录和技术记录。

6.3质量手册定义

gb/t6583定义。

质量手册是阐明一个实验室的质量方针，并描述质量体系的文件。

它既是质量体系的表征形式，又是质量体系建立和运行的纲领。

它对实验室的组织结构（含职责）、程序、活动能力（过程）和资源作出规定，是实验室长期遵循的文件。

6.4质量手册的分类

根据手册的内容和用途分为二类。

质量保证手册——用于证明，供客户使用，质量管理手册——用于运行，供实验室内部使用。

6.5质量手册的作用

编写质量手册的健全和完善质量体系的首要环节。

根据实验室的内外因素合理调整、选择体系要素，分配和落实质量职责，理顺管理关系，明确管理责任，合理安排各类文件的层次，把实验室积累的经验变成法规性文件。

协调各工作环节的准则。

内部质量审核的依据；对外证实实验室的质量保证能力，提高客户的信任度。

6.6质量手册的特征

•以客户为关注焦点：

以病人为中心，为临床服务•领导作用：

创造使员工能够充分参与实现目标的环境•全员参与：

各负其责

•过程方法：

将资源和活动作为过程进行有效管理•管理的系统方法：

各个过程的有效连接•持续改进：

根据实际不断完善

•基于事实的决策方法：

遵循科学，实事求是出报告•与供方互利的关系：

相互协作，共同获利

6.7质量手册的结构•封面

•批准页。

包括实验室名称、标志，发行版次，生效日期，批准人签名，手册编号，受控状态。

•实验室公正性声明

•修订页：

以表格描述修订序号、修订的章节条款和简要内容、批准人及日期。

•目录：

各章节条款的名称及页码

•前言：

介绍实验室的一般情况和手册的适用范围以及手册中术语或缩略语的定义•手册的管理：

对手册的保存、分发、评审、修订以及保密作出规定•质量方针及目标

•组织结构及人员责权利关系

•要素描述：

由系列sop文件对溯源、人、机、料、样、法、测等质量诸要素的陈述•支持性文件：

包括实验室平面图、人员一览表、仪器设备一览表、引用标准及参考文献等

6.8标准操作程序

standardoperationalprocedure，简称sop。

程序的定义为：

为进行某项活动所规定的途径。

sop是临床实验室内部以文件的形式对质量活动用规定的方法进行连续而恰当的控制。

实验室的sop应涵盖所有的质量活动，包括检测或校准计划、管理性程序、技术性程序、项目操作程序和记录表格等。

由于影响每个实验室的质量活动的条件和因素不一样，一个sop只在某个实验室内有效，而不一定适用于其他实验室。

6.9标准操作程序的一般要求

•对完成各项质量活动的方法作出规定，每个sop都应对一个或一组相互关系的活动进行描述；

•每个sop应说明该项质量各环节的输入、转换和输出所需的文件、物资、人员、记录以及它们与有关活动的接口关系；

•规定开展质量活动的各个环节的物资、人员、信息和环境等方面应具备的条件；•明确每个环节转换过程中各项因素的要求，即由谁做、做什么、做到什么程序、达到什么要求，如何控制、形成什么记录和报告，以及相应的审批手续；•规定在质量活动中需要注意的例外或特殊情况的纠正措施；•sop应简练、明确和易懂并且工作人员熟练掌握和严格遵守。

6.10推荐pcr实验室质量手册目录1.质量方针和宗旨2.工作制度

2.1实验室的设置、布局及组织结构2.2实验室内务管理制度2.3实验室的人员配置及管理制度2.4生物防护与安全制度2.5实验室废弃物处理制度2.6实验室清洁消毒制度2.7仪器设备的管理制度

2.8仪器、试剂、耗材购置程序及管理制度2.9临床标本的管理制度2.10实验室记录的管理制度2.11质量控制工作管理制度2.12结果报告管理制度2.13岗位责任制2.14抱怨制度3.操作指导书（sop）3.1消毒标准操作程序

3.2超净工作台使用标准操作程序3.3超净工作台维护和保养标准操作程序3.4pcr仪使用标准操作程序3.5pcr仪维护和保养标准操作程序3.6台式离心机使用标准操作程序3.7高速冷冻离心操作标准操作程序3.8移液器使用标准操作程序3.9加样器校准标准操作程序3.10冰箱维护和保养标准操作程序3.11电热恒温水浴箱操作程序3.12电子天平使用和校正操作程序3.13可移动紫外消毒车使用操作程序3.14温度计校准程序3.15试剂的质检操作程序3.16标本唯一标识编号编制规则3.17临床标本的采集及处理操作程序3.18临床标本的保存程序

3.19乙肝病毒核酸扩增荧光检测标准操作程序3.20室内质量控制标准操作程序3.21室间质评标准操作程序4.引用图表

4.1实验室组织结构图4.2实验室工作人员一览表4.3人员培训计划及培训记录表4.4主要仪器设备一览表4.5临床送检标本流程图4.6pcr扩增可接受标本记录表4.7pcr扩增拒收标本记录表4.8室内质控结果记录表4.9室间质控记录表4.10消耗性材料验收记录表4.11试剂验收记录表4.12故障处理表4.13仪器设备使用记录表4.14仪器设备维护保养记录表4.15实验室清洁消毒记录表4.16工作区温度、湿度记录表4.17抱怨记录表

4.18标本超低温保存记录表4.19应急处理记录表4.20垃圾处理记录表4.21冰箱温度记录表4.22水浴箱温度记录表4.23移动紫外消毒车记录表4.24设备校正记录表4.25检测结果报告流程4.26报告单样张6.11文件格式一目的二范围三职责四工作流程五引用文件及表格

6.12写作技巧

•目的：

why，为什么要开展这项活动•范围：

what，活动涉及的方面•职责：

who+what，谁做，谁负责

•工作流程：

列出活动顺序和细节，明确各环节“输入——转换——输出”，即做何事（what）、何人做（who）、何时做（when）、何地做（where）、如何做（how）•引用文件和表格：

开展此项活动涉及的文件、标准以及使用的表格、证明文件和记录保存期

7评审中常见问题

7.1手册

文件不全，无系统性；质量要素描述不全；格式不对；与实际工作脱节；无现行有效性（无手签，各区无相应手册）；记录不全、不规范

7.2人员

人员档案：

每人一个档案袋，有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等。

培训计划及实施记录：

每人有年度、季度、月的培训内容及实施记录；内容包括外出学习、进修，内部质量手册学习、业务学习、新项目引进等。

7.3设施与环境

通风、紫外、清洁、消毒的程序及记录、生物安全防护的程序及记录、生物垃圾的处理。

7.4仪器设备

采购程序及验收标准；校准程序及状态标识，使用、维护、保养的程序及记录；档案：

每个与检测质量相关的设备均应建档，内容包括：

设备的名称；制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；接收日期和启用日期；）目前放置地点；接收时的状态（例如全新的、经改装的）；仪器使用说明书或其复印件；校准和/或检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期；迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；损坏、故障、改装或修理的历史。

7.4料（试剂、耗品）

采购程序及领用记录，质检标准、程序及记录，应急程序；缺货、试剂变质；室内质控品。

7.5样（品）

标本唯一编号，年月日项目顺序号；标本采集标准操作程序；标本接受（拒收）标准、交接记录；标本保存、销毁的程序及记录；标本处理标准操作程序

7.6（方）法

方法学的有效性——依据；sop的合理性——生搬硬套；分区操作的协作——流程合理；质控点的安排——提取效率、扩增效率；基线的调整——ct值、本底荧光值。

7.7（检）测

•室内质控的sop：

耗品质检，试剂质检，质控方法（纠错措施），质控图。

•室间质评的sop：

纠偏措施

7.8报告

•发放范围：

门诊、病区、外单位•发放方式：

保密、电子、邮件

•报告单的格式：

唯一编号、检测下限、实验室申明•审核、标准、不合格报告的处理

7.9抱怨

•实验室服务、质量改进的依据

•对象。

病人、医生、工作人员。

sop应明确方式、职责、反馈、记录。

摘自《xx年华东区临床检验中心协作线临床实验室质量管理

及新技术应用高级研讨会资料汇编》

第四篇：

强县扩权推进过程中存在的问题及对策文章标题：

强县扩权推进过程中存在的问题及对策

为落实党的十六大关于发展壮大县域经济、统筹城乡发展的精神，从xx年起，浙江、湖北、河南、广东、江西、河北、辽宁等省先后实施了“强县扩权”的改革，即赋予少数区位优势明显、有望培育为未来地区性中心城市的县（市）与省辖市相同的经济管理权限和部分社会管理权限。

以减少管理层次，提高效率，降低行政成本，推动扩权县（市）抓住机遇，促进城乡经济和区域经济协调发展。

强县扩权后，计划直报机遇增加，项目申报成效显著，财政结算、资金拨付效率明显提高，政策信息渠道畅通。

从而使其经济活力显著增强，政府财力稳步增长，综合实力逐步壮大。

但同时也看到，在强县扩权改革推进的过程中，也暴露出一些问题值得关注。

存在的主要问题

一是部分扩权政策落实不到位

强县扩权后，应享有计划直接上报、项目直接申报、用地直接报批、信息直接获得等与省辖市相同的经济管理权限和部分社会管理权限。

但实际上，省辖市及部分省直部门未将有关权限直接交由扩权县（市）行使，存在着由省辖市管理和省、市两级双重管理等现象，造成扩权政策未能落实到位。

如在有的省份科技部门的信息获得、项目申报和环保部门的项目审批、计划上报等行政事务仍然需要通过省辖市的有关部门来完成。

扩权政策仍未完全落实到位。

二是省辖市对扩权县（市）的支持力度减弱

近年来，中央和省级政府为了推动县域经济的快速发展，加大了对重点领域和重点项目资金的投入力度，其中部分项目配套资金需要省、市、县三级政府及有关部门共同承担。

但扩权以后，一方面，多数省辖市认为扩权县（市）财政体制已经上划，对应承担的配套资金不再安排；另一方面，而省财政在下达资金计划时，资金配给比例依然按照原来的三级负担的原则，造成了原来应由省辖市配套的部分项目资金安排落空，这样就给县市发展带来很大资金制约。

如在某县调查时发现，基建、社保等资金配套缺口达到xx多万元，缺口数额与该县总配套资金相当，在项目资金总投入上占一定比例。

三是省直部门在扩权政策中定位模糊

这些部门在地方经济发展中具有举足轻重的地位，调查中发现他们在扩权政策中定位模糊。

一是部分省直职能部门不到位，缺乏相关的实施细则等配套性文件，没有制定本领域的扩权县实施办法，政策定位模糊，落实不到位，仍沿用“老套路”，凭“老感情”安排，个别处室仍将文件传至省辖市或要求出具省辖市相关文件或意见。

二是垂直部门在扩权政策中没有明确定位，如金融、工商、税务等垂直部门各自都有自上而下的一套行政体制和管理体制，扩权政策在这种既成的事实面前显得苍白无力。

四是协调量增大

扩权带来的这部分县（市）事实上与原来隶属的省辖市管理脱钩，滋生了与原来省辖市的矛盾。

一方面扩权县既要主动维护省一级部门的话语权，还要维护旧“主人”的关系，同时要参加省市双重会议，增加了这些县（市）进行协调的量。

另一方面扩权县（市）的领导干部任命权仍在省辖市，致使扩权县的部分权限得不到保障。

如，某扩权市财政体制不直接与省结算，部分财政收入仍划归省辖市所有。

五是缺乏督导协调，功效不平衡

落实政策是出台政策的目的。

有些省委、省政府出台政策后，多次会议强调落实，但仍存在政策不到位、监督不力、检查不够等情况，缺乏统一协调机构，整个扩权情况无从了解掌握。

对扩权县（市）来说，无牵头组织，群龙无首。

领导层面很难掌握扩权的具体内涵，然后逐一分析，解决对接中的具体困难，部门领导凭良心干，有些遇项目必争，有些却不管不问，能干多少干多少，没有压力也没有目标，实际效果差别很大。

建议对策

一、完善制度，确保政策落到实处。

目前省直管县改革中存在的问题表面上是扩权县（市）与省、市对接不好，沟通不好，对扩权政策不熟知，政策用得不足，不活，但实际上是缺乏相关实施细则，一些应该下放到县（市）的管理审批权限没有下放，仍需到市里办理，扩权政策执行不彻底。

这就需要中央、省出台一些文件，进一步明确省、市、县三级的权责关系，以保证强县扩权的推进力度。

二、因地制宜，实施地区分类改革。

就全国而言，由于各省在经济实力、地域面积、人口数量、社会关系方面差别很大，面临的问题也十分复杂，因此改革不能“一刀切”。

笔者认为，可根据地区自身状况，因地制宜，实行三种改革方案：

一是在已经形成区域经济中心和积极构建区域经济中心的发达地区，如北京、上海等城市，可重点加大推进“撤县（市）建区”的力度。

为构建区域经济中心，较发达的地级市也适当可扩大管辖范围，改近郊县全部或部分为市辖区，或将几个近郊县部分区域划归市辖。

二是在西部面积比较大的欠发达地区，如青海、xx等省区，在区划没有调整的情况下，仍维持目前的行政管理格局，但可向县级单位下放一些权力。

三是在上述两种情况外的大部分区域，积极探索省管县的改革，条件成熟时实行从财政体制过渡到行政体制意义上的省直管县。

三、认真研究，合理界定各级政府的事权。

在大力发展县域经济，解决“三农”问题的政策背景下，县级政府承担的责任重大。

为了增强其发展经济和实现小康社会的积极性和主动性，使县级真正成为一个“完整的政府”，省级政府应把大量的行政审批权限和经济管理权下放到县级行政单位，部分中央和省级垂直管理单位也应考虑放权，充分激发各级政府及政府