PCR实验室污染与对策_精品文档.pdf

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PCR实验室的污染与对策实验室的污染与对策河北医科大学第三医院河北医科大学第三医院冯忠军冯忠军PCR技术是一种体外模拟自然技术是一种体外模拟自然DNA复复制过程的核酸扩增技术，该技术通过制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复重复高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸等简单的等简单的3个温度循环，能将靶个温度循环，能将靶DNA扩扩增数百万倍，获得极高的检测增数百万倍，获得极高的检测敏感性。

敏感性。

30次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon难忘的难忘的1995年年-被称之被称之为为PCR临床检验爆炸年？

临床检验爆炸年？

天下大天下大乱！

乱！

到天下大治！

到天下大治！

但令人头痛的问题是但令人头痛的问题是易易污染污染，极其微，极其微量的污染即可造成假阳性的结果。

如果形量的污染即可造成假阳性的结果。

如果形成气溶胶污染而扩散，则可引起整个成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实实验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的验室的污染，处理起来非常麻烦，严重的甚至要关闭甚至要关闭PCR实验室。

实验室。

某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所幸的是经过一段时间的处理，最终将幸的是经过一段时间的处理，最终将PCR实实验室污染排除掉了。

验室污染排除掉了。

一次实验室污染的经历一次实验室污染的经历（一一）实验室实验室情况情况l实验室设置实验室设置实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标区三个区，试剂存放在试剂准备区，标本是在标本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩本制备区处理，处理完的标本置于扩增区上机扩增。

增。

l使用试剂使用试剂试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提供的乙型肝炎病毒供的乙型肝炎病毒（HBV）荧光定量荧光定量PCR试剂。

试剂。

l操作人员操作人员经过卫生部临检中心或省临检中心理论和操经过卫生部临检中心或省临检中心理论和操作培训并通过考试取得合格证。

作培训并通过考试取得合格证。

（二二）污染的污染的发现发现2004年年8月月12日，该实验室按正常的操日，该实验室按正常的操作规程检测作规程检测HBVDNA标本，同时设立了阴性标本，同时设立了阴性对照和阳性对照对照和阳性对照（均为试剂盒中配备均为试剂盒中配备），扩，扩增结束分析结果时，发现增结束分析结果时，发现HBVDNA所有所有的的标标本本及阴及阴、阳阳性对性对照均照均为为阳阳性，性，提示操作过提示操作过程中出现污染，但具体是什么原因引起的程中出现污染，但具体是什么原因引起的污染还不清楚。

污染还不清楚。

（三三）污染污染源源的的追踪追踪出现污染后，工作人员首先考虑可能出现污染后，工作人员首先考虑可能是是试剂试剂的污染，更换新批号的的污染，更换新批号的HBV试剂重新试剂重新检测后，结果仍然为全部标本阳性。

检测后，结果仍然为全部标本阳性。

将将HBV标本标本拿到其他正规的拿到其他正规的PCR实验室实验室检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴检测，结果标本中阴、阳性结果都有，阴性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标性对照是阴性，阳性对照是阳性，说明标本没有被污染。

本没有被污染。

将两种批号的将两种批号的HBV试剂拿到其他正规的试剂拿到其他正规的PCR实验室检测，也显示试剂没有问题。

实验室检测，也显示试剂没有问题。

该实验室用消毒液擦拭工作台面该实验室用消毒液擦拭工作台面后，打开所有的紫外灯照射一天，将后，打开所有的紫外灯照射一天，将所使用微量进样器、离心管、枪头、所使用微量进样器、离心管、枪头、手套、记号笔、记录本等都更换掉，手套、记号笔、记录本等都更换掉，再将再将HBV标本进行检测，结果全部标本标本进行检测，结果全部标本仍然为阳性。

仍然为阳性。

第二天，仍然用消毒液擦拭工作第二天，仍然用消毒液擦拭工作台面后，再打开所有的紫外灯照射一台面后，再打开所有的紫外灯照射一天，将天，将HBV标本重新检测，同时设置了标本重新检测，同时设置了两个阴性对照两个阴性对照（A和和B），A对对照照：

打开试剂反应管的盖：

打开试剂反应管的盖子，在空气中暴露子，在空气中暴露10min，盖上盖，盖上盖子，上机检测；子，上机检测；B对对照照：

试剂的反应管不开盖：

试剂的反应管不开盖子，直接上机检测。

子，直接上机检测。

结果：

全部标本和结果：

全部标本和A对照为阳对照为阳性，而性，而B对照为阴性。

对照为阴性。

至此，虽然还查找不到污染源是什么，至此，虽然还查找不到污染源是什么，但有一点可以肯定，但有一点可以肯定，PCR实验室污染是实验室污染是气溶气溶胶胶扩扩散而引起散而引起的的。

后来经过调查，发现污染是由于该实验后来经过调查，发现污染是由于该实验室新来了一个清洁工人，没有经过培训就直室新来了一个清洁工人，没有经过培训就直接上岗，在打扫实验室卫生时，接上岗，在打扫实验室卫生时，用用扩增扩增区区的的扫笤扫笤和和拖把拖把打打扫扫了标本了标本制制备区备区的的卫生卫生引起。

引起。

（四四）污染的污染的排除排除在确定了污染的原因后，工作人员就开始着在确定了污染的原因后，工作人员就开始着手排除污染，每天都打开整个手排除污染，每天都打开整个PCR实验室的门窗和实验室的门窗和排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个排气扇，让整个实验室通风，用消毒液擦拭整个PCR实验室，打开所有的紫外灯照射。

实验室，打开所有的紫外灯照射。

每隔每隔3d按上述步骤检测一次，一直这样处理按上述步骤检测一次，一直这样处理了一个多月，了一个多月，A阴性对照才转为阴性。

阴性对照才转为阴性。

连续连续检测三次检测三次A和和B阴阴性对性对照照,每每次次结果结果都均都均为为阴阴性性,才确才确定定PCR实验室实验室恢恢复复正正常常。

去去DNA清清洁洁液液PCR过程中，防止污染是很重要的一个过程中，防止污染是很重要的一个工作。

工作。

PCR只需几个只需几个DNA分子作模板就可大分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模模板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大板污染和交叉污染，这是造成假阳性最大的可能。

的可能。

（五五）体体会会开始做开始做PCR试验时，由于接受了“试验时，由于接受了“PCR极易污极易污染”这样的培训后，当然一点都不会马虎，每次染”这样的培训后，当然一点都不会马虎，每次PCR都做阴性对照和阳性对照，在相当长一段时间都做阴性对照和阳性对照，在相当长一段时间内都没有污染过。

内都没有污染过。

后来，渐渐就对书上说的那一套不以为然了，后来，渐渐就对书上说的那一套不以为然了，心里说：

我在阴性对照里面吐点口水，看你有没心里说：

我在阴性对照里面吐点口水，看你有没有阳性结果出来（不过，估计谁也没有真这么干有阳性结果出来（不过，估计谁也没有真这么干过！

呵呵）。

再后来，有可能做过！

呵呵）。

再后来，有可能做PCR就不再设对照就不再设对照了。

如果在后续工作中还没有出现什么问题，有了。

如果在后续工作中还没有出现什么问题，有的人便越发对污染看的淡了。

的人便越发对污染看的淡了。

通常我们对通常我们对PCR实验室污染的预防是采实验室污染的预防是采取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验取不同操作分区进行、分装试剂、改进实验操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭操作等规则，对污染的处理是用稀盐酸擦拭或浸泡、紫外线照射等。

而对于实验室的或浸泡、紫外线照射等。

而对于实验室的通通风风方面没有给予足够的重视，方面没有给予足够的重视，为了防止实验分区间之间的相互污染，为了防止实验分区间之间的相互污染，各个实验分区间都是尽可能的密闭，从而使各个实验分区间都是尽可能的密闭，从而使得实验室出现得实验室出现PCR产物残留污染的几率增大。

产物残留污染的几率增大。

从本次从本次PCR实验室污染排除的过程可以实验室污染排除的过程可以看出，污染得以排除的一个关键是通风。

看出，污染得以排除的一个关键是通风。

适当的给予实验室通风，可起到空气稀释适当的给予实验室通风，可起到空气稀释的作用，有利于的作用，有利于PCR产物残留量的减少，加产物残留量的减少，加快实验室污染的排除。

快实验室污染的排除。

将该将该PCR实验室的教训报告给大家，是实验室的教训报告给大家，是想引起各位同行对实验室通风给予足够的想引起各位同行对实验室通风给予足够的重视，不要再有类似的情况发生。

重视，不要再有类似的情况发生。

PCR实验室污染的原因实验室污染的原因（一一）标本间标本间交叉交叉污染污染:

1、收集标本的容器被污染；、收集标本的容器被污染；2、标本放置时，由于密封不严溢于容器外；、标本放置时，由于密封不严溢于容器外；3、容器外粘有标本造成相互间交叉污染、容器外粘有标本造成相互间交叉污染;4、标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪、标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染污染导致标本间污染;5、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或、有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染.（二二）PCR试剂试剂的污染的污染:

主要是由于在主要是由于在PCR试剂配制过程中，由试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染核酸模板污染.（三三）PCR扩增扩增产物产物污染污染这是这是PCR反应中最主要最常见的污染问反应中最主要最常见的污染问题题.因为因为PCR产物拷贝量大，远远高于产物拷贝量大，远远高于PCR检检测数个拷贝的极限，所以极微量的测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性污染，就可造成假阳就可形成假阳性.还有一种容易忽视，最可能造成还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.PCR实验室污染的监测实验室污染的监测一个好的实验室，要时刻注意污染的监一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染、什么原因造成的污染，测，考虑有无污染、什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染以便采取措施，防止和消除污染.PCR实验，不在于是不是能扩增出带来，实验，不在于是不是能扩增出带来，而是在于是不是有重复性、是不是有统计而是在于是不是有重复性、是不是有统计性、有没有设对照，其实这性、有没有设对照，其实这3点做任何实验点做任何实验都是必需的，尤其是对照，前两点对分析都是必需的，尤其是对照，前两点对分析单次实验结果可能影响不大，但对照就不单次实验结果可能影响不大，但对照就不一样了。

如果一样了。

如果PCR有问题，没有对照很难分有问题，没有对照很难分析原因的，即便是析原因的，即便是PCR出的结果很好，没有出的结果很好，没有对照也无法说明是不是假阳性，关键还是对照也无法说明是不是假阳性，关键还是对照。

对照。

但据了解，好多操作人员往往会省掉但据了解，好多操作人员往往会省掉对照。

建议做对照。

建议做PCR至少要加一个阴性对照，至少要加一个阴性对照，再加的话加阳性对照。

再加的话加阳性对照。