原代肿瘤细胞的分离培养.docx

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原代肿瘤细胞的分离培养

原代肿瘤细胞的分离培养

原代肿瘤细胞的分离培养

实验目的：

从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞

实验器材：

新鲜人体乳腺癌组织

　　　　　胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×）

　　　　　手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱

实验原理：

酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。

胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚

法。

此观察方法优点是视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单。

缺点是：

透明标本对比度低，标本没有立体感。

相差：

利用被检物体的光程（折射率x厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。

鉴定活体细胞最实用、最经济的方法。

荧光：

物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。

即：

物质吸收短波光，发射出的长波光。

荧光显微镜利用荧光光源激发样品中的荧光物质，检测激发光的情况

以上各种观察方法配合活细胞孵育装置，即可完成对活细胞的各种观察要求。

活细胞孵育装置通过软件或TFT触摸屏中Incubation模块进行精细的调节。

二、系统开关机

开机顺序

1.打开显微镜电源总开关

2.打开显微镜开关

3.拍荧光时打开荧光光源

4.打开电脑及软件

关机顺序

先关软件，然后是荧光光源、显微镜开关、电源开关！

！

三、明场观察成像操作流程

1.开总电源,显微镜开关（“ON/OFF”）孵育装置及电脑

2.打开卤素灯的光闸“TL”使光线透过聚光镜穿透样品

3.调节光强，光路100%转到眼睛

4.聚光镜打到H位

5.反射镜转轮打到BF明场位置

6.低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，然后再调至高倍

7.准备拍照了，首先光路切换至相机

8.打开软件，点开Live按钮

9.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——如果彩色模式拍照需要做自动或互动式白平衡（Whitebalance，Interactive）——再次曝光后——Snap成像——保存Save

10.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

四、相差观察成像操作流程

1.开总电源,显微镜开关（“ON/OFF”）孵育装置及电脑

2.打开卤素灯的光闸“TL”使光线透过聚光镜穿透样品

3.调节光强，光路100%转到眼睛

4.聚光镜根据物镜后面的Ph标注打到Ph1/Ph2或Ph3位

5.反射镜转轮打到BF位

6.低倍（如10X倍）下观察样品，通过X/Y拉杆移动载物台至目标位置，并通过粗细调焦旋钮聚焦，进而转到高倍，根据个人不同需求

7.准备拍照了，首先光路切换至相机

8.打开软件，点开Live按钮

9.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——彩色模式下做白平衡——再次曝光后——Snap成像——保存Save

10.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

五、荧光观察成像操作流程

1.开总电源,显微镜开关（“ON/OFF”），荧光光源，孵育装置及电脑

2.先按明场或相差观察方法找到阳性信号

3.关闭卤素灯光闸”TL”，打开荧光灯光闸“RL”

4.反射镜转轮根据标记探针的颜色打到GFP，Rhod或DAPI

5.准备拍照了，首先光路切换至相机

6.打开软件，点开Live按钮

7.先曝光Exposure——对照Live结果进一步精细聚焦——调节曝光时间——Snap成像——保存Save

8.拍照完毕，先关软件，再关显微镜，孵育装置及电脑

六、活细胞时序连拍流程

时序模块可用于获取一定时间内的一系列图像，如活细胞长时间的观察和拍摄，生成的图像就是一个时间序列，可用于分析随时间变化的过程。

1.首先放好样品，调好曝光时间和焦距。

2.恒温孵育装置的各参数通过软件调节，在工作区找到Incubator可以对活细胞的环境条件：

温度，CO2-或O2的浓度进行精细调解。

3.在工作区激活MultidimensionalAcquisition下的属性页。

4.在Experiment属性页选择Timelapse功能。

5.输入需要的时间间隔，例如2分钟。

时间单位可以从下拉菜单中选择。

6.然后输入想要获取的图像数目（#Cycles）。

从这两个数字可以计算出总的实验时间。

7.用户也可以输入时间间隔和总的持续时间，系统会自动计算图像数目。

选择需要计算的功能，也可以直接在输入区输入数值，然后单击键进行计算。

8.单击start开始取图。

取图进度通过一个进度条显示。

单击Cancel即可取消取图。

9.生成的图像显示在图像区，在这里可以用播放器对它进行操作。

该图象还未被保存，这时可以看见图象名字是*号。

最后保存或者导出图象即可完成一份时序连拍图。

肿瘤干细胞分选与鉴定技术

原理

肿瘤干细胞是肿瘤组织中少数具有无限增殖潜能的细胞，有很强的迁移、浸润、转移能力，能驱动肿瘤的形成和生长。

肿瘤干细胞纯化和培养是研究肿瘤干细胞各种生物学特性的基本手段。

目前肿瘤干细胞一般有以下几种分离方法：

（1）悬浮成球法

（2）磁珠分选法（3）流式分选法。

流式分选法以其高敏感性和高特异性被广泛的应用于肿瘤干细胞的分选。

本实验我们利用EpCAM标记肝癌干细胞并利用mofloXDP将其分离培养。

方法与步骤

1、细胞准备

将huh7细胞消化后离心，用PBS洗两遍离心并加100ulPBS悬浮；

4℃抗体孵育30min；

用PBS清洗两遍，离心后用PBS重悬等待上机。

仪器调试准备

（1）开机，将液流调试好后，用Beads矫正好仪器;

（2）清洗仪器，按照无菌水、酒精、无菌水的先后顺序各冲洗10min;

（3）冲洗好仪器后，用仪器自带软件计算dropdealy;

（4）仪器准备好后，在软件上画好图。

3、分选

（1）成球分选

将96孔板加入200ul成球培养基，用流式分别将1个与10个EpCAM+/EpCAM-细胞加入96孔板。

克隆形成

分选将24孔板加入500ul成球培养基，用流式分别将50个与100个EpCAM+/EpCAM-细胞加入24孔板。

增殖分选

将96孔板加入200ul成球培养基，用流式分别将1000个EpCAM+/EpCAM-

细胞加入96孔板。

其他实验分选

将其剩余的细胞两路分选入接收管中。

注意事项

消化细胞的过程中防止细胞消化过度。

如果消化过度会造成DNA外露造成细胞粘连成团，堵塞仪器。

上机分选前，细胞悬液中加入7AAD以排除死细胞。

死细胞可以从以下三个方面影响分选纯度死细胞容易结合抗体，使肝癌干细胞的比例升高；死细胞的抗原表位容易发生变化可以特异性的结合抗体；死细胞的本底荧光高，影响抗体的表达量。

用表面maker标记肿瘤干细胞时，我们往往选择抗体表达量高的群体。

分选细胞中的双联体或多联体可以结合更多的荧光抗体，因此分选细胞时要将这部分细胞除去。

无菌操作。

Western操作步骤

1、收集细胞，加入100μl裂解液和1μl蛋白酶抑制剂（比例100:

1），置于冰上30min；

2、4℃离心，15000rpm，15min；

3、吸上清液于新EP管中（约60~80μl）；

4、按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明测蛋白质浓度；

5、加入电泳加样缓冲液（与吸取的上清比例为1:

4），煮沸10min，缓慢恢复室温后，稍离心，可置于-20℃保存，实验时取出；

6、制备凝胶：

将洗净且干燥的两块玻璃板底端对齐后安放在灌胶支架上，参照分离胶配制体系依次加入各个组分，混匀。

将配置好的凝胶，沿玻璃板的一角小心缓慢注入，防止产生气泡。

根据梳子深度确定灌制高度，通常距离矮板至少2cm，灌好后，注入酒精或水封胶。

此时可按照配方配制5%浓缩胶，注意TEMED在灌胶前再加入。

7、静置一段时间待凝胶聚合（约30min）。

凝胶聚合后，弃去封胶溶液，并用吸水纸吸干。

往浓缩胶里加入适量TEMED，混匀后缓慢灌入到胶槽至矮板顶部，插上梳子，操作时避免产生气泡。

静置一段时间（约30min）至凝胶聚合。

8、上样及电泳：

安装电泳槽，注意确保内槽不漏缓冲液，往电泳槽加入足量电泳缓冲液，缓冲液要淹没过玻璃板和凝胶。

吸取适量样品和分子量标准Marker，缓慢加入至胶孔。

注意：

加样太快会使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出；加入下一个样品时，要注意更换枪头，以免交叉污染。

上样完毕后，盖上电泳槽盖子，接通电源，设置电泳条件，恒压100-120V（可以先80V，待跑过浓缩胶后加至100V或以上）。

电泳至溴酚兰刚跑出即可关闭电泳仪停止电泳。

9、转膜：

将玻璃板从电泳槽中取出，用塑料切胶器在玻璃板的两边轻轻撬动，至到小玻璃板开始松动。

除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，注意不要把分离胶刮破。

PVDF膜预先用甲醇浸泡5min，然后将转印膜、印迹滤纸和海绵垫浸泡于转移缓冲液中10min。

膜和印迹滤纸的大小应裁剪至与胶的大小相当。

在黑色面板上放置一层海绵垫，并依次放置至少3层印迹滤纸、凝胶、转印膜和至少3层印迹滤纸。

放置膜时尽量一次性准确放置，凝胶与转印膜一旦接触就不要再移动，并记住膜与胶的接触面。

玻璃试管轻轻滚压滤纸挤出气泡，并用海绵覆盖。

关上转印夹，合上锁扣。

安装好的转印夹应该使胶紧密地与PVDF膜接触而不被挤压。

将组装好的夹子装入转移电泳槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面。

添加电转缓冲液，盖好盖子，开启并设置电转条件，一般用150mA1-2h。

注意：

电泳转移时会产热，需要在电泳槽的一边放一些冰来降温。

10、免疫反应：

印迹后的PVDF膜用5%脱脂奶粉溶液室温孵育封闭2h，将抗体用一抗稀释液稀释至适当浓度，室温下孵育PVDF膜过夜。

11、用PBST在室温下摇床上洗3次，每次15min。

将过氧化物酶标记的二抗按照适当比例用PBST稀释（二抗的种属应和一抗一致），室温下孵育PVDF膜2h。

用PBST于室温下摇床上洗3次，每次15min。

12、ECL化学发光与X光片定影：

加入显色底物后按常规X光片显影方法将转印膜上的信号转移至X光片上。

RealTimePCR操作步骤

RNA抽提

1.所需材料试剂：

（1）.TaKaRaRNAisoReagent试剂

（2）.氯仿

（3）.异丙醇

（4）.75%乙醇（DEPC处理水配制）

（5）.RNase-free水（制备方法：

使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加入DEPC至终浓度0.01%（v/v），过夜搅拌后，高温高压灭菌。

（6）.尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

a）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。

b）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

（7）.用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟）或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用