多糖质谱鉴定.docx
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多糖质谱鉴定
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多糖质谱鉴定
篇一：
多糖化学结构鉴定方案总结
经过分级纯化的多糖在测定结构前须检查其纯度及测定分子量。
检查纯度最常用的判断方法：
（1）用gc、hpLc测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定。
用不同的柱型测定结果更为可靠。
（2）电泳只出现一条带。
如可用聚丙烯酰胺凝胶电泳、乙酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳。
对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。
（3）凝胶柱层析图呈现对称的单峰。
若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。
阴离子交换层析纯化
用DeAe一纤维素52（2.6x100cm）柱层析,0.lmol/Lnacl洗脱,流速6ml/h,按2ml一管分部收集,苯酚一硫酸法逐管检测,绘制收集体积与糖含量之间的关系曲线。
看是否有单一对称峰。
按照Ye等报道,采用DeAe一52一纤维素交换柱层析法（2.6x30cm）对鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖进行初步分离。
DeAe一纤维素凝胶预处理:
称取DeAe一52一纤维素凝胶干粉,加入约10倍体积质量比（ml/g）的0.5mol/Lna0h溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性;再用相同体积的0.5mol/LhcI溶液浸泡30分钟,倒出上清液,用大量去离子水反复浸洗至ph值近中性;最后用相同体积的0.5mol/lnaoh溶液再浸泡30分钟,用大量去离子水反复浸洗至ph值中性。
处理完毕后,进行湿法装柱,用去离子水0.5mol/Lnacl溶液,去离子水依次分别平衡（流速1.0ml/min）2一3个柱体积备用.
糖样100mg溶于5ml的去离子水中,离心除去不溶物,上样于DeAe一52一纤维素阴离子
-1层析柱（2.6x30cm,cl型）,分别采用去离子水0.1和0.3mol/LnacI溶液进行分段梯度洗脱,
流速1.0ml/min,自动收集器分部收集（10ml/管）,每梯度20管。
用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。
吸光值（490nm）为纵坐标绘制DeAe一52一纤维素色谱柱洗脱曲线。
依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除nacI及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得初步纯化产品。
初步纯化多糖得率计算公式:
多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%
葡聚糖凝胶层析纯化
采用sephadexg-100凝胶层析法对DeAe-52一纤维素初步纯化的不同组分的多糖样品进一步纯化。
葡聚糖凝胶（sephadexg一100）的预处理:
称取sephadexg一100凝胶干粉,加入30倍体积质量比（ml/g）的去离子水,沸水浴5小时使其溶胀。
冷却后用去离子水反复浸洗,减压脱气后进行湿法装柱,用0.1mna2so4;溶液平衡（流速0.25ml/min）2一3个柱体积备用。
分别称取经DeAe一纤维素一52初步纯化的各多糖组分样品20mg,溶于2ml0.1mna2so4溶液中,上样于sephadexg一100层析柱（2.6x60cm）用0.1mna2so4溶液溶液洗脱,流速0.25ml/min,分步收集（5ml/管）。
用硫酸一苯酚法跟踪检测各管多糖含量（490nm处吸收值）,以收集的管数为横坐标。
吸光值（490nm）为纵坐标绘制sephadexg一100色谱柱洗脱曲线。
依据洗脱峰型,合并相同组分,50℃旋转蒸发浓缩,对去离子水透析48h以去除na2so4;及小分子杂质,最后将透析内液冷冻干燥,得不同纯化产品。
纯化多糖得率计算公式:
纯化多糖得率（%）=纯化多糖质量/粗多糖质量x100%
（鲍氏层孔菌菌丝体粗多糖）
（4）纸层析法呈单一集中斑点。
取0.5%的多糖样品溶液50ul,点样于新华中速滤纸（3cmx20cm）距端点1cm处的中部,以正丁醇:
浓氨水:
水（4o:
50:
5）为展开剂,饱和2小时以上,在室温下展开6h,取出吹干,用0.5%甲苯胺蓝液染色,立即用95%乙醇漂洗至背景褪色,看是否只有一个清晰的斑点。
（5）琼脂糖（Agarose）凝胶电泳法
在琼脂糖板（厚度为0.2cm）上点样3一5ul采用浓度为0.075mol/L,ph8.6的巴比妥缓冲液,电泳1-1.5h,电压为64一80V,甲苯胺蓝（浓度为1%）染色,醋酸乙醇混合溶液（醋酸:
乙醇:
水=0.1:
5:
5）脱色。
多糖纯品经电泳展开后,看是否呈现单一斑点,斑点是否清晰。
（6）紫外分光光度法
将多糖pwZ加0.9%nacI溶液溶解,配成浓度为1mg/ml的溶液,采用uV一16oA紫外可见光谱仪扫描（200nm一30onm）观察260nm、280nm处是否有吸收峰。
多糖的分子量测定：
过去用超速离心沉降法、光散射法、渗透压法、粘度法（:
多糖质谱鉴定）等，这些方法操作复杂且误差较大，现已少用。
现在较常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法，这两种方法须先用已知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。
一般来说，多糖结构分析包括以下几点：
（1）单糖组成分析：
研究确定单糖的种类及摩尔比；
完全酸水解后用高效液相色谱方法（hpLc）或气相色谱方法测定。
（2）糖苷键类型：
研究确定糖苷键及支链点连接位置；
甲基化分析方法
高碘酸氧化法与smith降解法
（3）糖环大小：
研究确定糖苷键为呋喃糖或吡喃糖；
红外光谱
（4）异头碳构型：
研究确定糖苷残基的a-或p-构型；
2DnmR.（TwodimensionalnuclearmagneticResonance）光谱分析方法测
（5）确定单糖残基和重复单元的序列
甲基化分析方法与磁共振光谱分析方法结合分析，一般会参考多糖的单糖组成及摩尔比信息以利于解析多糖结构。
高碘酸氧化法
薄层层析（TLc）——定性，
气相色谱法
（6）取代基团位点：
研究0h-修饰基团的种类和取代位点，如0-磷酸化，乙醜基取代，0-
硫酷化等；
比色分析方法
（7）多糖分子量分布的研究。
紫外光谱
定性与定量方法
薄层层析：
残基定性
气相色谱：
残基定量
气质联用：
残基定量
高效阴离子色谱法：
残基定量
鉴定结构常用物理化学方法：
高效液相色谱:
确定单糖组分和相对分子量
红外光谱分析:
测定多糖的官能团，不仅可以检测酮糖、酵糖的耻喃糖环或呋喃糖环的构象和糖苷键的构型
核磁共振:
α-构型与β-构型残基的比例；判断异头碳构型；推断主链和支链连接键型鉴定结构复合方法：
甲基化分析:
推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例
高碘酸氧化法与smith降解法:
判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度及支链多糖的分支数目
糖睛乙酸酷衍生物的气相色谱法:
单糖组成和摩尔比
各种多糖化学结构鉴定方法的具体实施方案
1、酸水解
（1）完全酸水解
-1称取20mg样品,加入2mL2mol·L的h2so4于安培管中沸水浴水解8h,水解液用
baco3中和至ph=7,离心,取上清夜置冰箱冷藏备测。
（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）
（2）部分酸水解
称取糖样70mg，80℃条件下，0.05m三氟乙酸水解2h。
降至室温后，离心（4000r/min，10min），将沉淀干燥，留做gc分析。
上清用无水乙醇除酸至中性（ph为6～7），蒸馏水透析48h：
将袋外透析液浓缩，真空干燥，留做gc分析；袋内液浓缩至5ml左右，加10倍体积无水乙醇，醇沉过夜，离心（4000r/min，10min），沉淀常规干燥，作gc分析；上清浓缩，真空干燥，留做gc分析。
2、高效液相色谱
确定样品的单糖组成
色谱条件为:
色谱柱为shodexKs804sugar（300mm×7.8mm）
柱温40度
流动相为水
-1流速0.8mL·min
检测用410RⅠ示差检测器，数据处理用810gpc软件进行。
同时用鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、果糖、葡萄糖、岩藻糖8种单糖进
行对照,根据峰值确定样品的单糖组成。
分子量的测定以标准分子量的葡聚糖pulluan作分子量测定标准。
让其通过高压液相色谱柱,条件同上,先以分子量对数与对应的保留时间作标准曲线,从标准葡聚糖pulluan的工作曲线上可以求得该成分分子量。
例如：
（阿魏侧耳子实体多糖分离纯化及其化学结构的初步研究）
将水解后的多糖样品pw2进行hpLc分析,结果如表所示:
阿魏侧耳子实体多糖pw2经过酸水解后,得到2种单糖:
葡萄糖和半乳糖,摩尔比例1.77∶1。
例如：
4经hpLc测定后对照标准曲线得多糖pw2的分子量为3.18×10。
（阿魏侧耳子实体多糖
分离纯化及其化学结构的初步研究）
4、甲基化分析
（1）基本原理
先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化，然后将多糖中的糖苷键进行完全酸水解，水解后得到的化合物，其羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点。
同时根据不同甲基化单糖的比例，可以推测出此种连接键型在多糖重复结构中所占的比例。
用此种方法得到的羟基及nabh4还原醛基后产生的羟基，经乙酰化可得到甲基化的糖醇乙酸酯（此产物易挥发，可进行gc分析），再经gc与gc-ms分析，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱谱图的主要离子碎片的分析便可以较准确地确定糖的连接键型。
反应通式如下
:
（2）甲基化反应
取充分干燥的多糖样品10mg，溶解在2.0ml的二甲基亚矾（Dmso）中。
在n2保护下快速加入干燥的naoh粉50mg，用n2排出空气，加盖密封，室温反应1.0h并间歇振荡。
在n2保护下缓慢滴加碘甲烷1.0ml，用n2排出空气，加盖密封，室温继续反应1.0h并间歇振荡，反应完成后加0.5ml水终止反应。
反应液先用自来水流水透析48h，再用蒸馏水透析24h，透析液冷冻干燥得第一次甲基化样品。
第一次甲基化样品继续甲基化，反应步骤同上，得第二次甲基化样品。
如此重复甲基化三次。
甲基化后的样品用红外光谱检测，3700
cm-1—3100cm-1，附近无羟基的特征吸收峰，表明甲基化反应完全。
（3）甲基化样品的衍生化
上述完全甲基化多糖样品加入2mol/1的三氟乙酸（TFA）3.0ml,120℃密闭水解2.0h。
冷却后50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干得完全甲基化多糖的水解产物。
加蒸馏水2.0ml使其溶解，再加硼氢化钠25mg，振荡后室温还原反应2.0h。
反应完后滴加0.1mol/1醋酸分解过量的硼氢化钠并调ph值至5.5~7.0弱酸性。
反应液50℃减压蒸发蒸干，加2.0ml甲醇再蒸干，重复三次，最后蒸发干。
上述蒸发干样品加入1.0ml醋酸酐和1.0ml吡啶，封管后在沸水浴中反应1.0h。
反应液50℃减压蒸发干，加2.0ml甲醇再蒸发干，重复三次，最后蒸发干。
加入丙酮1.0ml，用0.45ul尼龙微孔滤膜过滤，取样进行gc/ms分析。
（4）衍生化样品的gc/ms分析
多糖样品经甲基化、水解、还原、乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，进行gc/ms联机分析，根据文献的相对保留时间和不同单糖的主要离子碎片（m/e），推断出多糖样品中糖基的连接方式及各种连接键型的比例。
本实验采用的条件为:
gc（Variancp3800型）和ms（Variansatum2200型）气相一质谱联用仪，Db-5ms石英毛细管柱（30mx0.25mmx0.25um）;程序升温，初温80℃，保持1min，以8℃/min升至210℃，保持1min，再以20℃/min升至260℃,保持1min;氦气作载气，进样口温度250℃，分流比1:
50，柱流速1.0ml/min;电子电离源（eI源）70eV，倍增器电压350V，灯丝电流250uA，接口温度260℃,离子源温度180℃，质荷比（m/z）扫描范围30~450，扫描速率2.5scan/sec。
（胞式层孔菌菌丝体多糖分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究）
流程图如下：
（mAep-2a-2b是安络小皮伞菌丝体多糖的某个过程中第某个样品）
篇二：
1多糖含量检测
亿信检测推出单糖组成方案
简介：
gc-ms（气相质谱联用技术测定单糖组成）
1多糖含量检测
方法：
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物,再以比色法测定。
该法为糖类检测过程中通用的测定糖含量方法。
2多糖的单糖组成和摩尔比检测
1仪器
图1安捷伦gcms检测仪
2方法：
多糖全水解-乙酰化-gcms
3示例图谱
图
2多糖样品全水解
-乙酰化-gcms总离子流图
图3标准单糖乙酰化gcms谱库匹配图
3多糖分子量分布范围检测
1仪器
图4安捷伦1200高效液相色谱仪
2方法：
hpLc-gpc-RI
3示例图谱（标准曲线）
篇三：
多糖结构检测
多糖检测
一．
定性：
1．a-奈酚试液（molish）反应为普遍采用的多糖的定性方法，但专属性差，
无法对普通多糖、糖肤、糖蛋白及普类做出专属性鉴定。
2．溶解性
3．葱酮-硫酸试剂反应（阳性）
4．苯酚-硫酸反应
5．十六烷基三甲基澳化按（cTAb）络合反应
6．比旋光度
7．特性粘度
8．电导率及ph值
9．红外光谱（lR）分析，主要用于不同糖的鉴别、糖昔键及搪构型的确定、糖键上主要取代基的识别等。
常用方法是将干燥的多糖用Kbr压片法在400~4000cm-1区间扫描做红外光谱分析
定量：
1．苯酚-硫酸法是主要的多糖定量方法之一，缺点是苯酚容易被氧化，临用前需对试剂进行
纯化处理，否则影响测定结果的准确度
2．葱酮一硫酸法也是常用的多搪定量方法，缺点是葱酮试剂不稳定，溶液需临用前配制，
相比之下，本法优于苯酚一硫酸法。
3．hpLc、hpec等方法。
二纯度和分子量测定
1．纯度评价
多搪的纯度不能用通常化合物的纯度标准进行衡量，因为多糖纯品在结构上也不是完全一致的，我们通常所说的多糖纯品实际上是一定分子量范围的均一组分。
测定多糖纯度常用的方法主要有:
①用gc、hpLc测定组成多糖的单糖的摩尔比是否恒定，用不同的柱型侧定结果更为可靠。
②电泳只出现一条带，如聚丙烯酞胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳及玻璃纤维纸电泳等。
对于中性多糖可采用高压电泳，以硼酸盐为缓冲液，可增大其迁移速度。
③凝胶柱层析图呈现对称的单峰。
若有“拖尾”现象，说明其均一性不够好。
④纸层析法呈单一集中斑点
2．分子量测定
多糖的分子量测定至今仍是一个复杂的问题。
现在还没有一种准确的测定方法。
因多糖的分子量只代表相似链长的平均配布。
往往用不同的方法会测得不同的分子量。
即使是同一多搪，其重均分子量（mw）与数均分子量（mn）也会相差很大。
多糖的分子量测定常用的方法有凝胶过滤法和高效凝胶液相色谱法.它是根据在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的特性，先用各种己知分子量的多糖制成标准曲线，然后由样品的洗脱体积从曲线中求得分子量。
此两种方法须先用己知分子量的标准多糖对照测定样品的分子量。
3．结构分析
多糖的一级结构为初级结构，二、三、四级结构为高级结构。
一级结构是指糖基的组成，糖基排列顺序，相邻糖基的连接方式，异头碳构型以及糖链有无分支，分支的位置与长短等。
多糖的二级结构是指多糖主链间以氢键为主要次级键而形成的有规则的构象。
多糖的三级结构和四级结构是指以二级结构为基础，由于糖单位之间的非共价相互作用，导致二级结构在有序的空间里产生的有规则的构象。
多糖结构的描述包括以下方面:
分子量范围、单糖的组成、单糖的连接点类型、单糖和糖昔键的构型、重复单元。
多糖的结构分析可分为化学方法、仪器分析法和生物分析法。
化学分析法：
该类方法已较成熟。
a）酸水解：
鉴别单糖的组成，进而得出组成多糖的各单糖的摩尔比。
现己达到完全自
动化。
b）甲基化：
对于阐明单糖的连接方式（键型）、重复结构中某种单糖的数目、末端搪的
性质以及分支点的位置等非常有用。
c）过碘酸及其盐的氧化：
多糖因其有邻二醇、邻三醇结构而易被过碘酸盐氧化开环。
通过测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。
d）smith降解：
利用稀酸在室温下对多元醇进行部分酸水解，结果得到各种赤藓醇糖
苷或丙三醇糖昔，研究这些单糖昔、二糖昔或寡糖昔的结构有利于阐明多糖中单糖的部分连接顺序和键型。
e）碱降解：
碱降解发生在单糖的羧基或羟基连接的酯上，多糖还原端的单糖被逐个剥
落，可分析多糖的键型。
仪器分析法:
a）IR：
IR在多搪结构分析上主要用于确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。
一般主要观察730-960cm-1的范围。
b）核磁共振法州（nmR）：
用nmR技术研究糖链结构的优点是不破坏样品。
糖链的结构
特征通过化学位移，偶合常数，积分面积，noe及驰豫时间等参数表达。
一维nmR包括和1hnmR和13cnmR。
1hnmR主要解决多糖结构中糖昔健的构型，’3cnmR化学位移范围远较IhnmR宽，解决异头碳的构型问题，确定多糖残基中取代位置和分支点，判断多糖中各残基的种类和比例。
c）ms、gc-ms：
gc分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但gc-ms是多搪结构
分析不可缺少的工具，特别是对水解单搪、甲基化单糖及甲基化寡聚糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。
ms由于其方法快速灵敏、样品用量极少而在糖链结构分析中得到越来越广泛的应用。
在鉴定各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少。
近年来各种软电离技术的诞生，如决原子轰击质谱（FAb-ms）、电喷雾质谱（esI-ms）、基质辅助激光解析离子化质谱（mALDI-ms）等出现，使得质谱还可用于测定糖链的分子量及糖链的一级结构。
生物方法:
a）酶解法:
由于酶对多糖的专一降解特性，使酶在多糖的结构研究上起到了一定的作用。
让多搪与不同的酶发生反应，根据使多糖降解的酶的种类，可确定多糖搪昔键的构型。
b）免疫学方法:
一定结构的多糖（寡糖）会抑制抗原一抗体的结合，不同的搪（半抗原）有不同
的抑制常数。
通过测定某种未知结构的糖链的抑制常数再与己知结构的糖链相比较，可分析糖链结构。
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