第五章 微生物遗传变异与菌种选育.docx
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第五章微生物遗传变异与菌种选育
第五章微生物遗传变异与菌种选育
第一讲（3学时）
教学目的及要求
掌握微生物遗传变异的物质基础及其结构、特点；掌握基因突变的实质、类型、特点和突变机制；
重点
微生物遗传变异的物质，基因突变实质、类型、特点和突变机制，
难点
基因突变实质、类型、特点和突变机制。
教学方法
课堂讲授法，多媒体图片演示，同时采用提问法、比较教学法、总结教学法、反馈教学法，进行知识的讲解。
课程导入
证明DNA是微生物的遗传物质的三个经典实验方法
教学内容
微生物遗传变异的物质基础，微生物遗传、变异的概念，二者的相互关系，证明DNA是微生物的遗传物质的三个经典实验方法，微生物遗传变异的物质，基因突变实质、类型、特点和突变机制。
在自然界中,各种生物都存在着遗传和变异的现象,微生物也不例外。
遗传核变异是生命活动的基本特征之一。
遗传：
具有一定遗传型的个体在一定的培养条件下生长时，子代培养物会表现出与亲代培养物相同的特征，这就是遗传现象。
（各种生物都能产生与自己相似的后代，让亲代的性状能够在子代中得到表现。
）
变异：
当遗传型发生改变，也就是说当生物体内的遗传物质发生结构上的变化时，生物体就表现出变异现象。
（任何一种生物，无论是亲代与子代之间，还是子代之间，总能觉察出不同程度的差异。
）
遗传和变异是一对既相互独立，又同时并存的矛盾。
没有变异，生物界就失去进化的材料，遗传只能是简单的重复；没有遗传，变异不能积累，变异就失去意义，生物也就不能进化。
一般来讲，遗传只是相对的，而变异总是绝对的，正是由于这对矛盾双方的不断斗争，才推动生物不断地向前发展。
1.遗传变异的物质基础
早在19世纪，人们就已经认识到生物体具有遗传性和变异性什么是生物的遗传物质？
这个问题在一个时期内一直争论不休。
直到大量事实证明脱氧核糖核酸（DNA）真正的遗传物质后，才算解决。
在证明DNA是生物的遗传物质的大量实用中，有三个经典的实验，下面分别加以介绍。
1.1遗传物质的证明
（1）转化实验
（2）噬菌体感染实验
（3）病毒的拆开与重组实验
1.2DNA的结构与复制
1.2.1DNA的结构
双螺旋分子结构：
由两条方向相反的多核苷酸链组成，他们平行地围绕着同一个轴右旋盘曲而形成双链螺旋。
双链螺旋中，两条多核苷酸骨架由糖和磷酸组成，位于链的外侧，碱基则位于链的内侧，两条链通过碱基间的氢键连接起来。
碱基间的氢键连接并不是随意的，而是严格按照A与T、G与C相配的原则进行，其中A与T之间形成两个氢键、G与C之间形成三个氢键，这称为碱基配对。
DNA由4种脱氧核糖核酸变化排列组成的大分子。
但各种生物DNA的4种碱基（base）含量往往是不均等的，而且在各种生物中这4种碱基的含量之比反映着种的特性。
各种微生物中的A=T，G=C。
A为腺嘌呤核苷（adenosine），T为胸腺嘧啶核苷（thymidine），G为鸟嘌呤核苷（guanosine），C为胞嘧啶核苷（cytidine）。
但G+C/A+T则随着微生物的种类不同而不同，这数值小到0.45，大到2.73。
DNA分子的化学结构组成
1.2.2DNA的复制
DNA分子结构及其半保留复制
半保留复制：
在特定位点解链，分别以拆开后的双链中的一条为模板，以四种脱氧核苷酸为底物，在RNA聚合酶的催化下合成RNA引物，然后在依赖于DNA的DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补原则，合成两条与模板互补的新链。
在一边复制的同时，新合成的DNA分子一边形成双螺旋结构。
2.突变类型
2.1按突变涉及的范围
广义的突变包括染色体畸变和基因突变，前者指的是染色体结构和数目的改变，后者指的是由于DNA链中一对或少数几对碱基发生改变，而导致核苷酸序列突然放松时稳定的、可遗传的变化，它比染色体畸变更为常见。
狭义的突变仅只基因突变。
无论出现的是哪一种情形，都将导致mRNA上转录信息的改变，进而使翻译出来的蛋白质的氨基酸序列发生改变，并最终反映在细胞形态或生理的改变上。
2.2按突变所带来的表型改变
有天然的、非突变性状的微生物称为野生型菌株，而发生了突变的微生物称为突变型菌株。
突变株可能在形态、营养要求、遗传控制机制、对化学药物的抗性、对温度的适应性以及酶的功能等方面发生变化。
按照突变株表型特征的不同，基因突变的类型主要以下几种。
（1）形态突变型
形态突变型指的是细胞或菌落的外在形态发生变化的突变类型，又称为可见突变。
例如，细菌产生鞭毛、芽胞、荚膜能力的消失或恢复，放线菌、霉菌产孢颜色的变化，菌落形态、大小、质地、颜色的变化等。
（2）致死突变型
是指由于突变而导致个体死亡或丧失繁殖能力的突变类型。
这类突变类型在微生物中研究得不多。
（3）条件致死突变型
细胞中许多基因的翻译产物对于细胞的生长是必需的，如果这些基因发生改变将导致细胞的死亡，因此不可能将这类突变分离出来。
在这种情况下可采用条件致死突变型，即菌体只能某种条件下表现出突变。
温度敏感突变型是最典型的条件致死突变型，突变株在低温下与其野生型菌株具有相同的表现型，但温度升高后却表现出突变特征。
它们的一种重要酶蛋白（例如DNA聚合酶、氨基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的。
其原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性。
例如，有些大肠杆菌菌株可生长在37℃下，但不能在42℃生长；T4噬菌体的几个突变株在25℃下有感染力，而在37℃下则失去感染力等。
（4）生化突变型
是指突变株的代谢途径发生改变，导致某一特定生化功能改变或丧失，但突变株在形态上没有明显变化的突变类型。
营养缺陷型是最常见的生化突变型，它是指突变株丧失了某种酶的合成能力，使得由该酶催化合成的某种生长必需的物质无法合成，而必需外源供给才能正常生长的一种突变类型。
常用影印培养法来检测营养缺陷型突变株。
抗性突变型是一类能抵抗有害理化因素的突变型。
根据其抵抗的对象可分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等突变类型。
它们十分常见且极易分离，一般只需在含抑制生长浓度的某药物、相应的物理因素或在相应噬菌体平板上涂上大量敏感细胞群体，经一定时间培养后即可获得。
抗原突变型指细胞成分尤其是细胞表面成分（细胞壁、荚膜、鞭毛）的细微变异而引起抗原性变化的突变型。
突变类型之间并不彼此排斥。
某些营养缺陷型具有明显的性状改变，例如粗糙脉孢菌和酵母菌的某些腺嘌呤缺陷型可分泌红色色素。
营养缺陷型也可以认为是一种条件致死突变型，因为在没有补充给它们所需要物质的培养基上不能生长。
所有的突变型可以认为是生化突变型，因为任何突变，不论是影响形态或者是致死，都必然有它们的生化基础。
突变类型的区分不是本质性的。
2.3按突变的条件和原因
（1）自发诱变
是指某种微生物在自然条件下,没有人工参与而发生的基因突变。
（2）诱发突变
是利用物理的或化学的因素处理微生物群体,促使少数个体细胞的DNA分子结构发生改变,基因内部碱基配对发生错误,引起微生物的遗传性状发生突变.凡是显著提高突变率的因素都称为诱变因素或诱变剂。
2.4突变的特点
突变具有如下特性：
①不对应性这是突变的一个重要特点。
即突变性状与引起突变的原因间无直接对应关系。
②自发性各种性状的突变，可以在没有人为诱变因素下自发发生。
③稀有性自发突变的频率是较低和稳定的，一般在10-6~10-9间。
④独立性在一个包括亿万个细菌的群体中，可以得到抗链霉素的突变型，也可以得到抗这一种或那一种药物的突变型。
抗某一种药物的突变型细菌往往并不抗另一种药物，某一基因的突变既不提高也不降低其他基因的突变率。
两个基因发生突变是各不相关的两个事件，也就是说突变的发生不仅对于细胞而言是随机的，对于基因而言同样也是随机的。
⑤诱变性通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率，一般可提高10~105倍。
不论是自发突变或诱变突变得到的突变型，它们间并无本质上的差别，诱变剂仅起到提高突变率的作用。
⑥稳定性由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定变化，所产生的新性状也是稳定而可遗传的。
这与由于生理适应所造成的抗药性有本质区别，由生理适应而造成的抗药性是不稳定的。
⑦可逆性由野生型基因变为突变型基因的过程称为正向突变（forwardmutation），相反的过程则称为回复突变（backmutation或reversemutation）。
实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。
回复突变率同样是很低的。
2.2基因突变的机理
2.2.1诱发机制
能显著提高突变率的物理或化学因素称为诱变剂。
诱变剂的种类很多，作用方式也是多种多样，但它们最终都通过改变遗传物质的结构而导致突变的发生。
不同的诱变剂作用于微生物细胞后可产生不同的诱变效应，有些诱变剂能产生多种诱变效应。
根据诱变剂的性状和作用方式，可将常见的诱变剂分为以下几类。
（1）碱基置换（substitution）对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤（microlesion），一般也称点突变（pointmutation）。
它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。
置换又可分为两个类：
一类叫转换（transition），即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；另一类叫颠换（transversion），即一个嘌呤被一个嘧啶或是一个嘧啶被一个嘌呤所置换。
对某一具体诱变剂来说，既可同时引起转换与颠换，也可只具有其中的一种功能。
①直接引起置换的诱变剂：
它们是一类可直接与核算的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。
种类很多，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基硫酸乙酯，N-甲基-N′-硝基–N-亚硝基脲，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。
它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并进一步使微生物发生变异。
在这些诱变剂中，除羟胺只引起G:
C→A:
T外，其余都是可使G:
C≒A:
T发生互变的。
能引起颠换得诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。
图6-9表示由亚硝酸引起的A:
T→G:
C的转换过程。
亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，故它能使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H），以及使胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U），从而发生转换。
它也可使尿嘧啶（G）变成黄嘌呤（X），但这时不能引起转换。
由亚硝酸引起的AT→GC转换过程。
He和Hk分别为烯醇式和酮式次黄嘌呤
②间接引起置换的诱变剂：
引起这类的诱变剂都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氨基尿嘧啶（5-AU）、8-氮鸟嘌呤（8-NG）、2-氨基嘌呤（2-AP）和6-氯嘌呤（6-CP）等。
它们的作用是通过活细胞的代谢活动渗入到DNA分子中后而引起的，故是间接的。
现已5-BU为例来加以说明。
5-BU是T的代谢类似物。
当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。
5-BU一般以酮式状态在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。
有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中，于是当DNA进行复制时，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的A:
T变成G:
C的转换。
从图中，可以看出5-BU的掺入引起的G:
C回复到A:
T的过程。
通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因。
另外，也可以知道，微生物像5-BU这类代谢类似物只能对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的ＤＮＡ却不起作用。
（２）移码突变（frame-shiftmutation或phase-shiftmutation）指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添（插入）或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。
在移码突变中，个别核苷的增加或缺失虽然只是使DNA得碱基顺序发生了微小得改变，但却会导致密码组的移动，使突变点后的密码发生转录和翻译得错误，甚至导致突变后代的死亡。
不过，由于一个氨基酸是由三个核苷酸所组成的三联体密码编码的，如果核苷酸的增加或缺失在几处同时发生，而前后突变点之间增加或缺失核苷酸树木的代数和为零、三获三的倍数时，后一个突变点以后的遗传密码又可以恢复正常了。
由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株（frameshiftmutant）。
与染色体畸变相比，移码突变也只是DNA分子的微小损伤。
移码突变的过程如下：
阐明了若干诱变剂的作用机制及诱变功能。
①正常DNA链上的三联密码子：
②第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：
③在第二个密码子上缺失一个碱基A后引起的变化：
④增添一个碱基或缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常：
⑤增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：
⑥如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：
（3）染色体畸变（chromosomalaberration）某些因子如X射线等的辐射和烷化剂、亚硝酸等，还可引起DNA的大损伤（macrolesion），即染色体畸变，不仅可发生染色体拷贝数的变化，而且更重要的是导致染色体结构上的缺失（deletion）、重复（duplication）、插入（insertion）、易位（translocation）、倒位（inversion）等事件。
染色体结构上的变化，又可分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。
染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化，例如发生染色体的部分缺失或重复时，其结果可造成基因减少或增加。
发生倒位或易位时，则可造成基因排列顺序的改变，但数目却不改变。
倒位是指断裂下来的一段染色体旋转180°后，重新插入到原来染色体的位置上，从而使其基因顺序与原基因顺序方向相反。
易位则是指断裂下来的一小段染色体在顺向或逆向地插入到同一染色体的其他部位上。
至于染色体间畸变，则指非同源染色体间的易位。
近年发现，有些DNA片段不但可在染色体与染色体之间，质粒与质粒之间，质粒与染色体之间移动和跳跃，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。
在这些DNA片段的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或使某些基因启动或关闭，结果导致突变发生。
这似乎就是自然界所固有的“基因工程”。
现已把在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA序列称作转座因子（transposibleelement），也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（moveablegene）。
2.2.2自然突变机制
2.2.3紫外线对DNA的损伤
已知的DNA损伤类型很多，机体对其修复的方式也各异。
发现较早核研究得较深入得是紫外线得作用。
嘧啶对紫外线得敏感性要比嘌呤强得多。
嘧啶得光化产物主要是二聚体和水合物。
其中了解较清楚得胸腺嘧啶二聚体得形成和消除。
紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。
二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。
在互补双链间形成嘧啶二聚体的几乎很少。
但一旦形成，就会防碍双链的解开，因而影响DNADE复壮和转录，并使细胞死亡。
微生物能以多种方式去修复损失后的DNA.
2.2.4DNA损伤的修复
DNA由于各种原因而受到损伤，这些损伤可由微生物本身存在于细胞内的各种修复系统加以修复。
修复可有光复活作用、切除修复、重组修复和SOS修复等不同方式。
（1）光复活作用（photoreactivation）
这主要是对由紫外线引起的DNA损伤进行修复。
紫外线可使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。
二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而可能引起突变或死亡。
在互补双链结构间形成嘧啶二聚体的机会较少，但一旦形成，就会妨碍双链的解开而影响DNA复制的转录，并使细胞死亡。
光解酶（photolyase）和O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶（O6-methylguaninemethyltransferase）在有光环境中能直接修复DNA而不需切除部分碱基。
嘧啶二聚体是一切光解酶的靶，此酶在黑暗中能专一性地识别并能与二聚体结合成酶-DNA复合物，在有光时可催化一个二次光化学反应，此反应利用可见光将环丁烷恢复成两个单独的嘧啶碱。
紫外线产生的两种嘧啶二聚体
①每个嘧啶环的第5和第6个碳跨环连结；②5＇嘧啶的6位碳与3＇嘧啶的4位碳相连；③胸腺嘧啶-胞嘧啶6~4产物；④相邻的胸腺嘧啶（左）和胞嘧啶（右）。
●为NH2。
（2）切除修复（excisionrepair）
如果DNA的损伤较为严重，就必须进行切除修复。
这是一种暗修复。
切除修复的遗传信息来自DNA双螺旋的互补链。
切除修复有多种方法将受损伤的碱基或DNA骨架片段除去。
所有的切除方法都基于在DNA受伤部位或是一条单链的断裂，或是产生了一个缺口，两个情况都提供了一个3＇-羟基末端，从此开始DNA聚合酶可合成新的DNA片段，以代替切去的部分，切除修复的酶是DNA聚合酶Ⅰ，此酶在一般情况下细胞突变体中的量是不足的，但在DNA严重损伤之后便大量合成此酶，以填补DNA的缺口。
DNA连接酶是修复中的另一个重要的酶，在DNA聚合酶作用之后，DNA连接酶便来封闭所留下的缺口。
（3）重组修复（recombinationrepair）
以上修复的信息来自模板，但某些损伤不能用模板作为信息来源，如复制叉后面的损伤，互补链双方的碱基都已损伤，或者是被一个象丝裂霉素C那样的致癌化学剂交叉连接着，这样就没有哪一方可做另一方的模板。
还有如互补双方的DNA片断都丢失了，更无可能互相参照修复。
在这种情况下，就只有从另外相同和相似的DNA分子上取得相应片断来修复，这种修复DNA的双链需要排列组合，称为重组修复。
重组修复的信息来源可来自复制的子代DNA，拷贝后的染色体、二倍体、同源染色体的相关片断等，但这些遗传信息的取得，都要通过重组。
重组修复的关键酶为重组修复酶（recombinationalrepairenzyme），在大肠杆菌中为RecA蛋白。
此酶能使DNA上损伤两侧的序列与携带有丢失信息的相应片段退火，从而对损伤链进行修复。
（4）SOS修复（SOSrepair）
SOS（国际通用的紧急呼救信号）修复是指紧急修复。
SOS是一组基因，它是DNA修复最重要最广泛的基因集团，通常称为DNA紧急修复基因（SOSDNArepairgene），它们为DNA的损伤所诱导。
这些修复基因包括recA、lexA、uvrA、uvrB、uvrC等。
这些基因在DNA未受重大损伤时受LexA阻遏蛋白的抑制，使mRNA和蛋白质合成都保持在低水平状态，只合成少量Uvr修复蛋白用于零星损伤修复。
一旦DNA受到重大损伤，少量存在的RecA蛋白立即与DNA单链结合，结合后其修复活性被激活，激活的RecA蛋白切除LexA阻遏蛋白，使基因得以修复表达，产生的修复蛋白对损伤的DNA部分（如形成的二聚体）进行切除而修复整个DNA。
因此SOS修复是DNA分子受到重大损伤时诱导产生的保护DNA分子的一种应急反应。
第一讲（5学时）
教学目的及要求
理解微生物的基因重组；掌握工业微生物菌种的选育及菌种保藏的方法，菌种衰退的识别、防止和复壮方法；
重点
工业微生物菌种的选育及菌种保藏的主要方法，菌种衰退的识别、防止和复壮方法。
难点
微生物的基因重组。
教学方法
课堂讲授法，多媒体图片演示，同时采用提问法、比较教学法、总结教学法、反馈教学法，进行知识的讲解。
课程导入
何为基因重组？
教学内容
微生物的基因重组，原核微生物的基因重组方法步骤，转化、转导和接合，真核微生物的基因重组，有性杂交、准性杂交，噬菌体的基因重组，微生物的菌种保藏及复壮。
3.微生物的基因重组
3.1原核微生物的基因重组
自然界的微生物可通过多种途径进行水平方向的基因转移，并通过基因的重新组合以适应随时改变的环境以求生存，这种转移不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且也发生在微生物与高等动植物之间，例如最近发现的引起人体结核病的结核分枝杆菌基因组上有8个人的基因，获得这些基因可以使该菌抵抗人体的免疫防御系统，而得以生存。
因此基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的重要动力之一。
3.1.1细菌的接合作用
（1）实验证据
接合作用是指通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。
该过程是在1946年由JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm通过使用细菌的多重营养缺陷型（避免回复突变的干扰），进行的杂交实验得到证实的。
从图可以看出，二株多重营养缺陷型菌株只有在混合培养后才能在基本培养基上长出原养型菌落，而未混合的二亲菌均不能在基本培养基上生长，说明长出的原养型菌落（由营养缺陷型恢复野生型表型的菌株形成的菌落）是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。
Lederberg等人的实验第一次证实了细菌之间可发生遗传交换和重组，但这一过程是否需要细胞间的直接接触则是由Davis的“U”型管实验证实的。
U型管中间隔有滤板，只允许培养基通过而细菌不能通过。
其二臂盛有完全培养基，当将两株营养缺陷型分别接种到U型管二臂进行“混合”培养后，没有发现基因交换和重组（基本培养基上无原养型菌落生长），从而证明了Lederberg等观察到的重组现象是需要细胞的直接接触的。
（2）F+×F-杂交
细菌的接合作用是由F因子介导的，显示大肠杆菌F因子的遗传图谱，其突出的特征是与转移有关的基因（tra）占了整个图谱的1/3，包括编码F-性菌毛、稳定接合配对、转移的起始（oriT）和调节等20多个基因。
在F+×F-的接合作用中，是F因子向F-细胞转移，含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。
杂交的结果是给体细胞和受体细胞均成为F+细胞。
接合过程分两步进行，即接合配对的形成和DNA的转移：
当由F因子编码的性菌毛（位于细胞表面）的游离端与受体细胞接触，使供体细胞和受体细胞连接到一块以后，性菌毛可能通过给体或受体细胞膜中的解聚作用（disaggregation）和再溶解作用（redissolution）进行收缩，从而使给体和受体细胞紧密相连。
紧接着便开始接合过程的第二步——DNA转移。
起动这一步的关键位点是OriT，该位点具有被trayⅠ编码的缺刻螺旋酶（nickasehelicase）识别的序列，该酶将其中一条链切断，并结合于被切断的5′末端，通过由并列在一起的给体和受体细胞之间形成的小孔进行单向转移，此转移链到达受体细菌后，在宿主细胞编码的酶（包括DNA聚合酶Ⅲ）的作用下开始复制，留在供体细胞内的单链也在DNA聚合酶Ⅲ的作用下进行复制，因此接合过程结束后，给、受体各含有一个F因子。
（3）Hfr×F-杂交
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