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我的论文中的实验方法

第二章含6×His标签T7Select10-3b载体的构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.1.1实验材料及试剂

宿主菌E.coliBLT5615Novagen公司

T7Select10-3b噬菌体Novagen公司

EcoRI/HindIIIEndModificationKitNovagen公司

DNALigationKitNovagen公司

T7Select10-3bCloningKitNovagen公司

DNaseITaKaRa公司

β-AgaraseTaKaRa公司

TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitTaKaRa公司

2000bpDNALadderTaKaRa公司

TaqDNA聚合酶TaKaRa公司

IPTGAMRESCO公司

DNA纯化试剂盒庄盟公司

其他常用试剂：

羧苄青霉素（Carb）、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、胰蛋白胨、酵母菌粉、琼脂、琼脂糖、NaCl、甘油、PEG8000等为进口分装或国产分析纯。

引物合成与测序由北京宝瑞通生物科技有限公司完成。

2.1.1.3主要试剂配制

LB液体培养基：

胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，pH7.0

LB固体培养基：

胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，pH7.0

LB半固体培养基：

胰蛋白胨10g/L；酵母菌粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，pH7.0

50mg/ml羧苄青霉素溶液:

Amp1g溶解于10mL蒸馏水中，过滤除菌，-20℃保存。

噬菌体提取缓冲液：

20mMTrisHCl，pH8.0，100mMNaCl，6mMMgSO4

50×TAE电泳缓冲液:

Tris24.2g，冰醋酸5.7mL,0.25mo1/LEDTA（pH8.0）20m1，

加蒸馏水至100mL，室温保存，使用时用双蒸水稀释至1×工作浓度。

1%琼脂糖凝胶：

琼脂糖1g，加入100mL0.5×TBE溶液。

2.1.1.4主要实验仪器

分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司，FA1104N

PH计上海任氏电子有限公司，6173

PCR仪WhatmanBiometra，T-Gradient

电泳仪北京六一仪器厂

自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂，SZ-93

紫外/可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司，TU-1810

生物洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司，BCN-1360B

手掌型离心机海门市麒麟医用仪器厂，Lx-100

高速冷冻离心机sigma，2-16K

液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司

电热恒温水浴锅北京市永明医疗仪器厂，DZKW-D-2

电热恒温干燥箱黄石市医疗器械厂，72-1

隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂，PYX-DHS

Fluor-S凝胶成像系统美国Bio-Rad公司

超低温冰箱海尔公司，-86℃ZKU-L200Eppendorf管若干（1.5ml、50ml），移液枪枪头若干（10μL-1000μL）

2.1.2方法

2.1.2.1T7Select10-3b宿主菌的培养

T7Select10-3b噬菌体的合适宿主菌株为E.coliBLT5615，加甘油存于-80℃中。

2.1.2.1.1初代培养

向20mL无菌LB液体培养基中加入20μL50mg/mLcarb，摇匀后接入200μLBLT5615，用含有20μL50mg/mLcarb的20mL无菌LB液体培养基做空白对照。

于37℃，220rpm摇床过夜培养。

2.1.2.1.2继代培养

1）向300mL无菌LB液体培养基中依次加入300μL50mg/mLcarb和2mL过夜培养的菌液。

用只含有20μL50mg/mLcarb的20mLLB培养基做空白对照。

于37℃，220rpm摇床培养。

2）约1.5h后，以空白培养基为对照测量菌液600nm波长下的吸光度，直到OD600值达到0.5。

加IPTG至终浓度1mmol/L，37℃继续摇床培养30min，得宿主菌悬液（最终OD600至0.6-1）。

2.1.2.2T7噬菌体的扩增

1）向培养好的宿主菌悬液中加入100μLT7Select10-3b噬菌体原液。

继续37℃，220rpm摇床培养，使宿主细胞裂解。

用不加T7噬菌体原液的宿主菌液做空白对照。

约1.5h后宿主细胞裂解，瓶内产生丝状沉淀。

3-4h，丝状物增多，溶液比以前澄清，裂解完毕。

2）向裂解液中加入12μL5mg/mLDNaseI，37℃摇床培养15min。

3）加入7.5gNaCl固体，充分振荡溶解。

分装于50ml离心管中，4℃10000rpm，离心10min。

4）取上清至无菌三角瓶中，加入30gPEG8000，使其充分溶解，4℃过夜储存。

6）将混合液分装至24个1.5mL离心管中，4℃10000rpm离心10min。

去除上清，将离心管倒扣在吸水纸上，使干燥沉淀。

8）每管加入150μL1MNaCl,10mMTris-HCl（pH8.0）,1mMEDTA的缓冲液，剧烈震荡，使沉淀溶解。

2.1.2.3T7噬菌体DNA的提取

1）将上述溶解液分装到1.5mL离心管中，每管加入等体积的Tris-饱和酚，颠倒混匀，4℃10000rpm离心10min。

取上层液相，再用等体积的Tris-饱和酚抽提两次。

3）取上层液相，加入等体积的氯仿:

异戊醇（24:

1），颠倒混匀，4℃10000rpm离心10min。

重复1次。

4）取上层液相，加入等体积的异丙醇，4℃静置2h。

4℃12000rpm离心5min。

去除上清，将离心管倒扣在吸水纸上，干燥沉淀。

6）加入0.5mL70%乙醇，颠倒清洗沉淀，4℃12000rpm离心5min，去除上清。

重复1次。

7）将沉淀干燥后，每管加入400μL无菌双蒸水，室温静置使DNA溶解。

用ND2000测OD260/OD280及OD260/OD230值。

另取5μLDNA溶液用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

2.1.2.4T7噬菌体DNA的双酶切及鉴定

酶切反应体系

T7DNA20μL（≤20μg）

10×MBuffer40μL

XhoI20μL

SacI20μL

ddH2O300μL

total400μL

37℃酶切4h，65℃热激10min。

取5μL酶切产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。

2.1.2.5T7载体臂的回收

将酶切产物进行0.5%低熔点琼脂糖凝胶电泳后，按照TaKaRaβ-Agarase说明书进行T7DNA载体臂的回收。

具体步骤如下：

1）用纸巾吸干凝胶表面液体，在紫外灯下切出含有目的DNA片段的凝胶。

将凝胶切成细块后移入已称重的EP中计算重量。

2）按照1mg=1μL计算凝胶体积，向胶块中加入1/10凝胶体积的10×β-AgaraseBuffer平衡体系。

65℃加热10min使琼脂糖融化，冷却至60℃后静置平衡5min。

3）加入β-Agarase60℃消化1h，每200mg（约200ul）0.5%的凝胶加1U（1ul）β-Agarase。

4）冰上放置15min，12000rpm4℃离心15min。

取上清液，加入盐溶液使其终浓度为：

2.0MCH3COONH4；0.15MNaCl；0.3MCH3COONa。

5）加入等体积异丙醇，充分混匀后-20℃冷却60min，12000rpm离心15min。

6）去除上清，用70%乙醇洗沉淀2次。

7）将沉淀干燥后，加少量无菌ddH2O室温静置溶解。

用ND2000测OD260/OD280及OD260/OD230值，-20℃保存备用。

2.1.2.6含6×His插入标签的制备

1）引物设计与合成

根据T7Select10-3b噬菌体的DNA序列，应用Primer5.0软件设计引物①、②，将6×His标签设计到上游引物中。

在上游引物及下游引物的5’端分别加入SacI及XhoI酶切位点。

1）

1）

1）1）

1）

1）

1）

1）

第二章吸烟者肺癌组织T7噬菌体cDNA文库构建

2.1材料与方法

2.1.1材料

2.1.1.1组织临床资料

3例吸烟者肺癌组织由河北医科大学第四医院提供，均为男性吸烟患者，处于

、

期，患者术前均未进行化疗、放疗，样本取出后立即置于RNALater中，-20℃保存。

2.1.1.2主要生化试剂及试剂盒

RNeasyMiniKitQIAGEN公司

PolyATtract®mRNAIsolationSystemIIIPromega公司

OrientExpressRandomPrimercDNASynthesisKitNovagen公司

EcoRI/HindIIIEndModificationKitNovagen公司

DNALigationKitNovagen公司

T7Select10-3bCloningKitNovagen公司

MiniColumnFractionationKitNovagen公司

2000bpDNALadderTaKaRa公司

TaqDNA聚合酶TaKaRa公司

IPTGAMRESCO公司

T7噬菌体载体上下游引物Novagen公司

2.1.1.3主要试剂配制

5×TBE缓冲液：

Tris碱54g/L，硼酸27.5g/L，EDTA（pH8.0）0.5mol/L。

使用时用双蒸水稀释至0.5×工作浓度。

1%琼脂糖凝胶：

琼脂糖1g，加入100mL0.5×TBE溶液。

2.1.1.4主要实验仪器

分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司，FA1104N

PH计上海任氏电子有限公司，6173

PCR仪WhatmanBiometra，T-Gradient

电泳仪北京六一仪器厂

自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂，SZ-93

紫外/可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司，TU-1810

生物洁净工作台北京东联哈尔仪器制造有限公司，BCN-1360B

手掌型离心机海门市麒麟医用仪器厂，Lx-100

高速冷冻离心机sigma，2-16K

液氮容器乐山市东亚机电工贸有限公司

电热恒温水浴锅北京市永明医疗仪器厂，DZKW-D-2

电热恒温干燥箱黄石市医疗器械厂，72-1

隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂，PYX-DHS

Fluor-S凝胶成像系统美国Bio-Rad公司

超低温冰箱中科生命科技股份有限公司，-86℃ZKU-L200Eppendorf管若干（1.5ml、50ml），移液枪枪头若干（10μL-1000μL）

2.1.2方法

2.1.2.1吸烟者肺癌组织的获取及保存

手术后将新鲜组织立即浸入RNALater中，-20℃保存备用。

2.1.2.2总RNA的提取和纯化

根据RNeasyMiniKit（购自QIAGEN公司）的说明书进行以下实验操作：

1）从RNALater保存的组织中剪取一块组织，确定组织的重量，并确保组织不大于30mg，将其放入容器中。

2）加入适当体积的BufferRLT（已加入βME），快速进行匀浆处理，直到组织彻底裂解。

（组织重量<20mg时，加入RLT的体积为350μL或600μL；组织重量为20-30mg时，加入的RLT体积为600μL）

3）13000rpm，离心3min，小心地将上清转移到一新离心管中。

4）向以上离心管中加入1倍体积70%乙醇，立即吹吸混匀，不要离心。

5）将所有物质（包括沉淀）转移到柱子上，轻盖管盖，13000rpm离心15s，弃去流出物。

样品多时可多次收集。

6）向柱子中加入700μLBufferRW1，轻盖管盖，13000rpm离心15s漂洗柱子，弃去流出物。

7）向柱子中加入500μLBufferRPE，轻盖管盖，13000rpm离心15s漂洗柱子，弃去流出物。

8）重复步骤7

9）把柱子放入一新收集管中，全速离心1min。

10）把柱子放入一新1.5mL离心管中，加30-50μLRNase-freewater至柱子中央，静置1min，13000rpm离心1min洗脱RNA。

11）如果预期RNA产量>30μg，用40μLRNase-freewater重复步骤10。

如果要得到高浓度RNA，用洗脱液重复10。

12）用核酸蛋白测定仪测定RNA的纯度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

2.1.2.3polyA+mRNA的分离纯化

使用PolyATractmRNAIsolationKit分离纯化mRNA，原理图如下所示：

图1PolyATtract®mRNA分离纯化示意图[77]

Fig.1SchematicdiagramofthePolyATtract®mRNAisolationprocedure

1）探针的退火

取一个经处理过的无RNA酶的1.5mL离心管，向其中加入0.1-1.0mg的总RNA，用无RNA水将总RNA稀释至500μL。

将离心管放入65℃水浴中热击10min，然后加入3μL生物素链接的oilgo（dT）探针和13μL20×SSC，轻轻混匀，静置使其降温，大约需要10min。

在这中间准备0.5×SSC和0.1×SSC。

2）配制洗涤液

1.2mL0.5×SSC：

30μL20×SSC+1.170mLRNase-free水

1.4mL0.2×SSC：

14μL20×SSC+1.386mLRNase-free水

3）清洗磁珠

从试剂盒中拿出磁珠储存液，轻弹管底使磁珠重悬，等其分散均匀后用磁力架捕获磁珠，使磁珠都吸附到管壁，大约需要30s，小心的除去上清（不能离心）。

用300μL0.5×SSC清洗磁珠，每次都使用磁力架捕获磁珠，并小心地移去上清，清洗3次。

洗涤后，重悬磁珠于100μL的0.5×SSC中。

（磁珠洗涤完后必须在30min内使用，磁珠不能重复使用）

4）捕获并洗涤oilgo（dT）-mRNA复合物

将1）中退火后的体系加到3）中重悬磁珠后的液体中，室温放置10min使其结合，中间每1-2min颠倒混匀一次，磁力架捕获磁珠，小心除去上清（注意不要搅动颗粒）。

用300μL0.2×SSC清洗磁珠4次，期间轻弹管底直至颗粒已被重悬。

最后一次漂洗后，在不搅动SA-PMPs的前提下，8000rpm，离心1min，尽可能多的移出上清。

5）洗脱mRNA

用100μL无RNA酶水重悬磁珠，磁力架捕获磁珠，将上清液转移到新的离心管中。

再用150μL无RNA酶水重悬磁珠，然后将两次的上清合并在一个离心管，总共250μL。

（如果这时有任何颗粒也被带到终溶液中，可用8000rpm，4℃，离心5-10min，小心地将RNA转移到一新的无RNA酶的离心管）

6）mRNA的冻干及溶解

用真空冷冻干燥机将250μLmRNA溶液冻干，大约需要2h，然后用10μLRNase-free水重新溶解。

2.1.2.4cDNA合成及末端平端化

2.1.2.4.1cDNA第一条链的合成

取经过处理的无RNase的1.5mLEP管，加入以下组分:

4μgpolyA+RNAsample,

1μgHindIIIRandomPrimers

xμLNuclease-freeWater

20μLTotalvolume

将以上组分混合均匀，70℃加热10min后，快速置于冰上3min，然后将其离心，使混合物保留在管底。

在以上体系中继续加入：

10μL5XFirstStrandBuffer

5μL100mMDTT

2.5μLMethylationdNTPMix

8.5μLNuclease-freeWater

50μLTotalvolume（包括MMLV，在第7步加）

轻轻混匀，37℃平衡1min，加800units（4μL）MMLV-RT，轻轻混匀，37℃平衡60min，70℃加热10min，置于冰上3min，短暂离心，使内容物保留在管底。

2.1.2.4.2cDNA第二条链的合成

在冰上加入以下试剂至第一条链反应物中

50μL第一条链cDNA

50μL5XSecondStrandBuffer

6μL100mMDTT

2μL10xMethylationdNTPMix

135.4μLNuclease-freeWater

50units（5μL）DNApolymeraseI

1.6units（1.6μL）RNaseH

250μLTotalvolume

将以上组分轻轻混匀，15℃温育90min；加入250μL苯酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1），涡旋振荡，然后12000rpm，4℃，离心5min。

取其上清于另一1.5mL离心管中，加1μL肝糖，250μL4M醋酸胺，300μL异丙醇，颠倒混匀。

室温静置20min，12000rpm，4℃，离心10min，去上清，用0.5mL70%乙醇和0.5mL无水乙醇重复漂洗沉淀，每次漂洗后离心3min，沉淀干燥后用20μLTE溶解.

2.1.2.4.3双链cDNA末端修饰

设计以下反应体系：

20μL双链cDNA

3μL10XFlushBuffer

1.5μL100mMDTT

3μL1mMdNTPs

1.5U（0.6μL）T4DNAPolymerase

1.9μLNuclease-freeWater

30μLTotalvolume

将以上组分轻轻混匀，置于11℃大约20min，然后加入20μLTE和50μL苯酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1），涡旋振荡后，12000rpm，4℃，离心1min。

取上清于另一1.5mL离心管中，加50μL氯仿:

异戊醇（24:

1），涡旋振荡30s，12000g，4℃，离心1min。

取上清于新1.5mL离心管中，加入1μL肝糖，50μL4M醋酸胺，250μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置至少1h，然后12000rpm，4℃，离心10min，去掉上清，用0.5mL70%乙醇和0.5mL无水乙醇重复漂洗沉淀，每次漂洗后离心3min，沉淀干燥后溶于10μLTE，-20℃保存。

2.1.2.5EcoRI/HindIII接头连接

10μLblunt-endedcDNAinTE

2μL10XLigationBuffer

2μL1mMATP

2μL100mMDTT

100pmol（2μL）DirectionalEcoRI/HindIIILinkers

5U（0.5μL）T4PolynucleotideKinase

0μLNuclease-freeWater

20μLTotalvolume（包括下面加的连接酶）

将以上体系置于37℃5min，然后将其置于冰上，加入6~8WeissUnitsT4DNAligase，16℃连接过夜。

2.1.2.6EcoRI和HindIII接头消化

将以上连接产物置于70℃大约10min，使连接反应终止，然后等其缓慢降至室温后，加入以下反应体系：

10μL10XHindIIIBuffer

65μLNuclease-freeWater

100U（5μL）HindIII

100μLTotalvolume

混匀体系，37℃温育2h。

在上述体系中再加入：

10μL10XEcoRIAdjustmentBuffer

100U（5μL）EcoRI

将反应体系混匀，在37℃温育4h，取出后用等体积的苯酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

1）纯化cDNA，cDNA存在于上清中，取其上清于一离心管中，然后立刻对cDNA进行片段大小分离。

2.1.2.7cDNA大小片段的分离

根据MiniColumnFractionationKit说明书进行实验操作：

1）取出装有凝胶过滤树脂溶液的试剂瓶，轻轻地颠倒混匀，使其中的凝胶过滤树脂充分悬浮，然后吸取2mL的树脂悬浮液到MiniColumn中（lmL的床柱体积大概需要2mL的悬浮液）。

2）当悬浮液中的液体下降到柱床的顶部时，加入lmLlx柱缓冲液，当缓冲液再次下降到柱床顶部时，再加入1mLlx柱缓冲液，这样连续加5次。

3）第5次加入缓冲液又降至柱床的顶部时，将2.1.2.6中所纯化的cDNA溶液加入到柱子中。

4）在cDNA溶液流入以上被平衡的树脂中后，用枪吸取200μL1x柱缓冲液加入柱子中（不要搅动胶的表面），使柱缓冲液通过树脂流出。

5）用枪吸取250μL1x柱缓冲液加入柱子中，然后取一新离心管收集流出的溶液。

（这部分液体包含cDNA的最大片段）

6）向上述收集的溶液中加入1μL10mg/mL糖原和150μL异丙醇（不需要加盐，柱缓冲液中已经包括盐），然后涡旋震荡混匀，室温放置。

7）大约10min钟后，取出离心管，进行离心，12000rpm，4℃，10min，去除上清，分别用0.5mL70%乙醇和0.5mL100%无水乙醇洗涤沉淀，然后12000rpm，4℃，离心5min。

8）倒掉无水乙醇，并用枪头将管壁的残留乙醇清除干净，将沉淀放置超净台进行干燥，然后用20μLTE溶解沉淀，-20℃保存。

2.1.2.8cDNA与T7载体连接

将T7载体和cDNA片段以摩尔比1：

3进行连接：

1.2μLcDNAfragments

1μLT7Select®VectorArms（0.5μg;0.02pmol）

0.5μL10XLigaseBuffer

0.5μL10mMATP

0.5μL100mMDTT

0.3μLSterilewater

1μLT4DNALigase

5μLTotalvolume

将以上体系轻轻吹吸混匀，短暂离心，使反应在管底进行，16℃连接过夜，4℃保存。

2.1.2.9连接产物体外包装

1）使T7Select®PackagingExtract在冰上解冻。

2）在25μL的包装蛋白中加入5μL的连接产物，用枪轻轻混匀，不要涡旋震荡，反应混合物在22℃温育2h。

3）加入270μL灭菌的LB或TB终止反应。

进行噬菌斑实验确定重组子的数量。

4）如果包装产物在24h以内不扩增，应加入20μL氯仿，轻轻颠倒混匀保存。

可以在4度保存一周以上。

如果要长时间保存，包装的噬菌体必须通过平板法或液体法进行扩增。

扩增的T7噬菌体cDNA文库可用于生物淘洗。

2.1.2.10T7噬菌体cDNA文库的鉴定

2.1.2.10.1原文库容量测定

1）以2％的接种量将大肠杆菌BLT5615菌种接种到LB液体培养基中（含Carb终浓度为50μg/mL），37℃，220rpm振荡过夜培养。

2）取0.5mL过夜培养的菌液于20mL液体培养基中（含Carb终浓度为50μg/mL