食品安全与卫生学实验设计终定.docx
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食品安全与卫生学实验设计终定
《食品安全与卫生学》实验设计
（09级食品质量与安全专业）
分组号:
7
设计者:
魏俊潇
参与者:
邓捷
冷嘉璐
李笑曼
时间:
12.05.14
实验一“鲜肉的质量评价”综合实验
设计内容：
以市售鸡肉样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、肉品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（pH计测定酸度、硫酸铜法测球蛋白）、微生物检验（大肠菌群国标法1/试管法）、兽药的免疫学快速检测（环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。
（勿删）
一、实验目的
本实验模拟工厂化生产过程，从原料肉的验收、品质评定、产品加工到产品的感官评价，确定产品种类，提出实验设计方案并实施，从中掌握主要肉类产品的基本生产工艺和加工制作方法，以提高解决实际问题的能力。
二、实验内容
1.取样方法
先将检样进行表面消毒（沸水内烫3s—5s，或烧灼消毒），再用无菌剪子剪取检样深层肌肉25g，放入灭菌乳钵内用灭菌剪子剪碎后，加灭菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入灭菌水225mL，混匀，即为1︰10稀释液。
2.感官检验GB/T5009.44-2003
原理：
肉在发生腐败变质时，会发生改变色泽、气味和硬度的现象，并形成气味。
方法：
鸡肉的感官检验包括看、触、嗅和剖四部分。
分别从颜色、气味等方面入手。
1.视觉检验：
自然光线下，观察肉的表面状态和色泽，以及有无血块、霉斑污染物，然后用刀顺肉纤维方向切开，观察断面色泽。
2.嗅觉检查：
常温下嗅其气味。
3.硬度检测：
用食指按压肉表面，触感其硬度指压凹陷的速度，或是否恢复，表面干湿及是否发粘。
3.理化检验
3.1肉酸碱度（pH值）测定
原理：
肉类腐败是蛋白质分解成氨和胺等碱性物质，使肉的酸度降低，肉的pH值变化在一定程度上反映了肉的新鲜度。
3.1.1仪器与药品：
天平、刀、250mL烧杯、100mL三角瓶、100mL量筒、10mL烧杯、温度计、滤纸、酸度计、pH标准缓冲液。
3.1.2方法：
用酸度计测定肉浸液的pH值。
3.1.2.1仪器校准：
（1）将“pH—mv”开关拨到pH位置。
（2）打开电源开头指示灯亮，预热30分钟。
（3）取下放蒸馏水的小烧杯，并用滤纸轻轻吸去玻璃电极上的多余水珠。
在小烧杯内入选择好的，已知pH的标准缓冲溶液。
将电极浸入。
注意使玻璃电极端部小球和甘汞电极的毛细孔浸在溶液中。
轻轻摇动小烧杯使电极所接触的溶液均匀。
（4）根据标准缓冲液的pH，将量程开关拧到0~7或7~14处。
（5）调节控温钮，使旋钮指示的温度与室温同。
（6）调节零点，使指针指在pH7处。
（7）轻轻按下或稍许转动读数开关使开关卡住。
调节定位旋钮，使指针恰好指在标准缓冲液的pH数值处。
放开读数开关，重复操作，直至数值稳定为止。
（8）校整后，切勿再旋动定位旋钮，否则需重新校整。
取下标准液小烧杯，用蒸馏水冲洗电极。
3.1.2.2测定：
（1）将电极上多余的水珠吸干或用被测溶液冲洗二次，然后将电极浸入被测溶液中，并轻轻转动或摇动小烧杯，使溶液均匀接触电极。
（2）被测溶液的温度应与标准缓冲溶液的温度相同。
（3）校整零位，按下读数开关，指针所指的数值即是待测液的pH。
若在量程pH0~7范围内测量时指针读数超过刻度，则应将量程开关置于pH7~14处再测量。
（4）测量完毕，放开读数开关后，指针必须指在pH7处，否则重新调整。
（5）关闭电源，冲洗电极，并按照前述方法浸泡。
3.1.2.3评定：
评定标准见下表：
pH值范围
评定结果
pH1值
6.0~6.5
正常
<5.9
PSE肉特征之一
pH24值
5.4~5.5
正常
>6.5
DFD肉特征之一
3.2球蛋白沉淀实验
原理：
肌肉中的球蛋白在水溶液中的溶解度随pH值升高而增大在肉的腐败过程中，pH值升高。
蛋白质在碱性溶液中能与重金属离子形成沉淀。
因此，可根据形成沉淀的情况判断肉的新鲜度。
3.2.1仪器与药品：
10%的硫酸铜溶液
肉浸液的制备：
将肉样捣碎，混匀，称取10.0g于锥形瓶内，加入100mL蒸馏水，摇匀，浸渍30min，过滤即得到待测肉浸液。
3.2.2测定：
在一支5mL试管中加入2mL肉浸液，在另一支试管中加入2mL蒸馏水作为对照。
然后分别加入5滴10%硫酸铜溶液，充分振荡后观察。
3.2.3判断：
试管中液体呈淡蓝色，并且透明，是新鲜肉，液体轻度浑浊或少量混悬物为次鲜肉，液体浑浊并有白色沉淀为变质。
4微生物检验—大肠菌群国标法
4.1原理：
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
最可能数，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
恒温培养箱：
36℃±1℃、冰箱：
2℃～5℃、恒温水浴箱：
46℃±1℃、天平：
感量0.1g、均质器、无菌吸管：
1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶：
容量500mL、pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4.3培养基和试剂
4.3.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤
成分
胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化钠5.0g；乳糖5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75g；磷酸二氢钾（K2HPO4）2.75g；月桂基硫酸钠0.1g；蒸馏水1000mL；pH6.8±0.2；
制法：
将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
4.3.2煌绿乳糖胆盐肉汤“
成分：
蛋白胨10.0g；乳糖10.0g；牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL；0.1%煌绿水溶液13.3mL；蒸馏水800mL；pH7.2±0.1；
制法：
将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
4.3.3磷酸盐缓冲液：
成分：
磷酸二氢钾（K2HPO4）34.0g；蒸馏水500mL；pH7.2。
制法：
贮存液：
称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。
稀释液：
取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15min。
无菌生理盐水:
称取8.5ｇ氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
无菌1mol/LNaOH：
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
无菌1mol/LHCl：
移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121℃高压灭菌15min。
4.4检验程序：
4.5操作步骤
样品的稀释
a.称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:
10的样品匀液。
b.样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
c.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:
100的样品匀液。
d.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
初发酵试验：
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
大肠菌群最可能数（MPN）的报告
按上述确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。
4.6报告
稀释度
1:
100
1:
1000
1:
10000
CFU/g
平均值
第一个样品
第二个样品
5环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法
5.1原理：
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可用于定性或定量分析。
5.2方法
5.2.1鸡肉样品处理
适量鸡肉（去除脂肪），剪碎后放入组织研磨器中，制成匀浆状；称取1g，移入5或15ml离心管内；加4mlPBS缓冲液，盖严，剧烈振荡10min；4000r/min离心10min，取上清于新管内为预处理样品溶液；取100μL预处理样品溶液/或试样溶液，加100μL保温液，混匀后取50μL用于检测；样品稀释倍数按10倍计。
5.2.2样品脱脂
将预处理样品溶液加入等量水饱和的正己烷，充分振荡后，4000r/min离心5min，弃去上层溶液及油脂，在下层清液中再加入水饱和的正己烷重复脱脂一次。
最后小心吸去上层溶液及油脂，下层清液即为试样溶液
5.2.3步骤：
1）用包被液将BSA-CPFX稀释至1ug/mL包被酶标板，100µl/孔,4℃，过夜或37℃，2h；
2）用pH7.4的PBST洗涤三次，250uL左右，手摇，每次45s；
3）环内沙星腹水抗体（1mg/mL）用保温液6万倍稀释；环丙沙星标准品（1mg/mL）用保温液按64、32、16、8、4、2、1、0ng/ml稀释；
4）先将各浓度标准品加入一列孔中（50ul/孔），再统一加稀释的腹水（50ul/孔），混匀后，37℃，45min；
5）用PBST洗涤三次，同上；
6）酶标羊抗小鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG，二抗）用保温液1：
5000倍稀释，每孔100µl，37℃温育45min；用PBST洗涤四次，同上；
7）加入底物溶液，每孔100µl，37℃温育20min，每孔滴加50µl终止液，酶联检测仪测定OD490值。
5.2.4数据分析
以标准品浓度的常用对数为横坐标，以抑制率[（A标/A0）×%]为纵坐标绘制标准曲线，并根据曲线的具体情况选择最佳的拟合模型。
其中A0为零标准品孔OD值，A标为各浓度标准品孔OD值。
实验二“生鲜牛乳质量评价”综合实验
设计内容：
以市售生鲜乳样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、乳品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（相对密度、酒精实验法测酸度）、微生物检验（菌落总数、大肠菌群国标法2/平板法、美蓝还原试验）、抗生素检测（嗜热链球菌抑制法/TTC法，乳酸链球菌由实验室提供）、掺假乳实验（掺淀粉、豆浆、碱、盐、甲醛等，可做验证实验）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。
一、实验目的
了解生鲜乳样的采集和保存方法，掌握乳新鲜度、密度、酸度、微生物含量、抗生素含量、掺假的检验方法。
二、乳样的采集和保存
生鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的正常乳。
采样前必须充分搅拌使混合均匀。
采用直径10mm镀镍金属管或玻璃管采样，从不同深度采样。
采样量若只测脂肪和酸度时50mL即可，若做全面分析取200～300mL，样品应做两个平行。
快速冷却保存：
0～5℃，1～2天；
不做细菌学检验时可加防腐剂保存：
每100mL乳加福尔马林1～2滴可保存10～15天；每100mL乳加H2O22～3滴，密闭，可保存6～10天。
三、感官检验
1.检验方法
1.1色泽：
白瓷皿中，检查是否带红色、绿色或明显的黄色；
1.2气味：
加热后，嗅其气味；
1.3滋味：
品尝；
1.4组织状态：
烧杯中，静止1h，小心倒入另一烧杯，看前一烧杯底是否有沉淀和絮状物，再取一滴于大拇指上，检查是否粘滑。
1.5杂质：
是否有豆渣、牛粪、昆虫等杂质。
2.判定标准
色泽
组织状态
气味
滋味
评定结果
为乳白色或稍带微黄色
呈均匀的流体，无沉淀、凝块和机械杂质，无粘稠和浓厚现象
具有乳特有的乳香味，无其他任何异味
具有鲜乳独具的纯香味，滋味可口而稍甜，无其他任何异常滋味
良质鲜乳
色泽较良质鲜乳为差，白色中稍带青色
呈均匀的流体，无凝块，但可见少量微小的颗粒，脂肪聚粘表层呈液化状态
乳中固有的香味稍使或有异味
有微酸味（表明乳已开始酸败），或有其他轻微的异味
次质鲜乳
呈浅粉色或显著的黄绿色，或是色泽灰暗
呈稠而不匀的溶液状，有乳凝结成的致密凝块或絮状物
有明显的异味，如酸臭味、牛粪味、金属味、鱼腥味、汽油味等
有酸味、咸味、苦
劣质鲜乳
四、理化分析
1．相对密度
1.1原理
使用密度计检测试样，根据读数经查表可得相对密度的结果。
乳的密度是指在20℃时，一定体积的质量与4℃同体积水的质量之比。
乳的比重是指在15℃时，一定体积的重量与同温同体积水的重量之比。
同温度下：
比重–密度=0.002
乳的密度和比重均可用乳稠计测定，乳稠计有20℃/4℃（密度计）和15℃/15℃（比重计）两种。
本实验中所用为乳密度计。
乳密度（ρ420）与乳稠计度数的关系式为：
乳稠计度数=（ρ420读数-1.000）×1000
例：
乳密度（ρ420）1.031，则其乳密度度数为31°，比重度数为31°+2°=33°
1.2仪器和设备
密度计：
20℃/4℃；玻璃圆筒或200mL～250mL量筒：
圆筒高度应大于密度计的长度，其直径大小应使在沉入密度计时其周边和圆筒内壁的距离不小于5mm。
1.3分析步骤
取混匀并调节温度为10℃～25℃的试样，小心倒入玻璃圆筒内，勿使其产生泡沫并测量试样温度。
小心将密度计放入试样中到相当刻度30°处，然后让其自然浮动，但不能与筒内壁接触。
静置2min～3min，眼睛平视生乳液面的高度，读取数值。
根据试样的温度和密度计读数查表换算成20℃时的度数。
1.4测定值校正
若乳温不是20℃时，则乳稠计读数应进行校正。
1）计算法温度每升高或降低1℃时，乳密度在乳稠计刻度上减小或增加0.0002°
2）查表法
根据牛乳温度和乳稠计读数，查牛乳温度换算见表5-1。
将乳稠计读数换算成20℃时的度数。
1.5判定标准
生鲜乳特级≥1.030；一级≥1.029；二级1.028；
消毒乳1.028~1.032
表5-1牛乳温度换算表
乳稠计度数
鲜乳温度（℃）
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
23.3
24.2
25.1
26.0
26.9
27.9
28.8
29.3
30.7
31.7
32.6
33.5
23.5
24.4
25.3
26.1
27.1
28.1
29.2
30.2
31.1
31.9
32.8
33.5
23.6
24.5
25.4
26.3
27.3
28.3
29.2
30.2
31.1
32.1
33.1
34.0
23.7
24.7
25.6
26.5
27.5
28.5
29.4
30.4
31.3
32.3
33.3
34.3
23.9
24.9
25.7
26.6
27.6
28.6
29.6
30.6
31.5
32.5
33.5
34.5
24.0
25.0
25.9
26.8
27.8
28.8
29.8
30.7
31.7
32.7
33.7
34.7
24.2
25.2
26.1
27.0
28.0
29.0
30.0
31.0
32.0
33.0
34.0
34.9
24.4
25.4
26.3
27.3
28.3
29.3
30.3
31.2
32.2
33.2
34.2
35.2
24.6
25.6
26.5
27.5
28.5
29.5
30.5
31.5
32.5
33.5
34.5
35.6
24.8
25.8
26.8
27.8
28.8
29.8
30.8
31.8
32.8
33.8
34.7
35.7
25.0
26.0
27.0
28.0
29.0
30.0
31.0
32.0
33.0
34.0
35.0
36.0
25.2
26.2
27.2
28.2
29.2
30.2
31.2
32.3
33.3
34.3
35.3
36.2
25.4
26.4
27.5
28.5
29.5
30.5
31.5
32.5
33.5
34.4
35.5
36.5
25.5
26.6
27.7
28.7
29.7
30.7
31.7
32.8
33.8
34.8
35.8
36.7
25.8
26.8
27.9
29.0
30.0
31.0
32.0
33.0
34.1
35.1
36.1
37.0
26.0
27.0
28.1
29.2
30.2
31.2
32.2
33.3
34.3
35.3
36.3
37.3
2．酒精实验法测酸度
酒精试验法取1~2mL乳于试管中，加入等量的中性酒精（68%或70%或72%的酒精），迅速充分混合，如有絮状物（蛋白沉淀）出现，即为酒精阳性乳，否则为酒精阴性乳。
出现絮状物表示酸度高，乳的酸度与酒精浓度见表5-2
表5-2乳的酸度与酒精浓度关系
酒精浓度（%）
出现絮状物的酸度
68
70
72
20oT
19oT
18oT
判定标准
生鲜乳特级≤18oT；一级≤19oT；二级≤20oT；
消毒乳≤18oT
2.1原理
以酚酞为指示液，用0.1000mol/L氢氧化钠标准溶液滴定100g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经计算确定试样的酸度。
2.2试剂和材料
除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T6682规定的三级水，中性乙醇—乙醚混合液：
取等体积的乙醇、乙醚混合后加3滴酚酞指示液，以氢氧化钠溶液（4g/L）滴至微红色，氢氧化钠标准溶液（NaOH）：
0.1000mol/L，酚酞指示液：
称取0.5g酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，并加入20mL水，然后滴加氢氧化钠溶液（8.1）至微粉色，再加入水定容至100mL。
2.3仪器和设备
天平：
感量为1mg。
15.2电位滴定仪，滴定管：
分刻度为0.1mL，水浴锅。
2.4分析步骤
称取10g（精确到0.001g）已混匀的试样，置于150mL锥形瓶中，加20mL新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液（14.2）电位滴定至pH8.3为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0mL酚酞指示液（14.3），混匀后用氢氧化钠标准溶液（14.2）滴定至微红色，并在30s内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入公式
（2）中进行计算。
五、微生物检验
1.菌落总数
1.1样品的稀释
称取25mL样品置盛有225mL无菌水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:
10的样品匀液。
1.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:
100的样品匀液。
1.3按1.2操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管
或吸头。
1.4根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），
在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
1.5及时将15mL～20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
1.6培养
⑴待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃±1℃培养48h±2h。
水产品30℃±1℃培养72h±3h。
⑵如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mL），凝固后翻转平板，按⑴条件进行培养。
1.7菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。
⑴选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
⑵其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
⑶当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
2.大肠菌群国标法2/
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