感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取.docx

感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取.docx

《感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

感受态细胞的制备质粒DNA的转化和提取

感受态细胞的制备

—LB液体培养基：

胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，1%（W/V），用固体NaOH调节pH为7.0~7.2，分装于三角瓶中，灭菌后存于室温。

摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制；

—0.1mol/LCaCl2：

称取1.47gCaCl2•2H20（Amresco分装）溶于100mL去离子水中，灭菌后存于4℃；

—离心管（50mL或80mL或100mL），灭菌；

—培养试管，灭菌；

—1mL枪头，灭菌；

—1mL加样枪；

—滤纸，用牛皮纸包好后灭菌；

—10mL量筒，灭菌；

—5mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌；

—冰，离心管架；

—恒温摇床，可见分光光度计，玻璃比色杯。

1．接种空白大肠杆菌于3mLLB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜；

2．将已培养好的种子液转入100mLLB培养基中扩大培养至OD650=0.3后，将培养好的细菌置于冰上冷却10min；

3．4℃，4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤纸上，将培养基控干；

4．用40mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。

冰上放置30min；

5．4℃，4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，再用4mL冰预冷的CaCl2悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4℃放置12~24h以增加其敏感性后使用。

6．如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100μL每管，再加入100μL甘油（注意：

甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。

），于液氮或-70℃冰箱中存放。

存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。

如果已经融解，应丢弃，而不能再冻结保存而继续使用。

注意事项：

1．本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。

空白菌可以于平板上划线后，用Parafilm包好后存于4℃，也可将液体培养物存于4℃。

但如果要长期保存，则应将细菌保存于50%的甘油中，存于-20℃或-70℃。

当接种的细菌是来自于-20℃或-70℃存放的液体培养物时，接种应迅速，不等解冻，立即从表面刮下一块冰后，将菌种迅速放回低温存放；

2．一般于3mLLB培养基中过夜培养12h后，菌体已很浓，可以进行扩大培养。

于100mL培养基中培养2~3h后，即可达到对数生长期。

但有时如果由于存放过久，或者已经过数次解冻，造成细菌生活力下降，则倍增时间会延长；

3．对OD值的监测，当肉眼看到菌体已很浓时，于超净台上取3mL测OD值。

开始可以每30分钟检测一次，越到后面检测的时间就应该缩短；

4．感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。

因此，所有操作均应在超净台上。

也可以在实验台上进行，但应在后面放一酒精灯，所有操作都不能远离火焰。

最好每次恰好做感受态之前，将所有的枪头和管子都灭一下菌，用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍；

5．感受态细胞的细胞膜比较脆弱，因此一当用冰冷的CaCl2悬浮以后，即不能剧烈震荡或快速抽吸；

6．根据我们的经验，纯度较高的含结晶水的CaCl2可以得到好的实验结果；

7．所有的枪头和管子均应干净。

如果有可能，都尽量用新的。

如果是用的回收的枪头，一定要看管壁是否干净。

8．扩大培养用的液体培养基体积可以调整。

调整后的CaCl2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。

9．以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间的延长而下降，所以最好是现做现用。

存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。

而对于转化PCR连接产物，建议用其它的感受效率更高的制备方法。

本节后的附4介绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方法。

质粒DNA的转化

—LB液体培养基：

见感受态细胞的制备；

—LB固体培养基：

于液体培养基中加入1.5%的琼脂粉。

不用在灭菌前溶化琼脂粉，灭菌完后，轻轻摇匀。

注意不能剧烈摇动，否则可能会使培养基暴沸；

—LB平板：

将灭菌后的固体培养基冷至60℃左右时，倒入90mm的培养皿中（约30mL。

如果先前已加入了抗生素，则还应在超净台上晃动培养皿几次；

—200μL枪头，1.5mLEp管，灭菌；

—42℃水浴；

—10μL，200μL加样枪；

—培养试管，灭菌；

—恒温摇床，恒温培养箱；

—菌液推棒；

—抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100mg/mL，溶于无菌水中，工作浓度100μg/mL，即每毫升培养基取1μL储液）；四环素（Tet）（储液，5mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50μg/mL，即每毫升培养基取10μL储液。

储液全部于-20℃保存）；

—冰；

1．如果是冻存的感受态细胞，先于冰上溶解；

2．加入用于转化的质粒DNA1μL；

3．冰上放置30min；

4．于42℃热击60s；

5．迅速放于冰上，5min后进行下一步；

6．将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管，该培养试管有已预热至37℃的LB液体培养基，使总体积为1mL，温和震荡（200rpm左右）培养1h；

7，将复苏的培养物倒入一Ep管中，4℃，4000rpm离心10min，将培养基倒掉，用残留的培养基悬浮，然后用加样枪将菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30min后，倒置培养过夜。

注意事项：

1．热击时间要根据所用管子的传热效率，薄壁管子的传热效率高，热击时间可以缩短到45s；

2．热击时，要使水浴尽可能不要流动，热击后应迅速放回冰上；

3．于37℃复苏细菌时，不能加抗生素，摇动也不能太过于剧烈；

4．对照的设置对于评价转化结果非常重要，将10μL感受态细胞分别涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上，如果感受态细胞没有问题，则应该在不含抗生素的平板上生长，而在含有抗生素的平板上不能生长。

5．一般转化细胞可以用其中的1/3涂布一个平板，2/3涂布一个平板。

不过，对于多拷贝质粒，也可以不用离心，取50μL涂布一个平板足矣。

质粒DNA的提取

—储液：

100mL1mol/LTris-HCl（pH8.0）：

称取Tris12.1g,用浓HCl调节pH为8.0，然后定溶至100mL，灭菌后存于4℃；100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0）：

称取18.6g二水乙二胺四乙酸二钠，加80mL去离子水，加热溶解，用固体NaOH调节pH为8.0，然后定溶至100mL，灭菌后存于4℃；100mL10%SDS，称取10g十二烷基硫酸钠于80mL去离子水中，加热溶解后存于室温；2mol/LNaOH10mL，称取0.8g固体NaOH溶解，定溶至10mL，于塑料瓶中室温存放，可以不灭菌。

—溶液I：

每配制100mL，称取葡萄糖0.9g（50mmol/L），1mol/LTris-HCl（pH8.0）2.5mL（25mmol/L）,0.5mol/LEDTA（pH8.0）2mL（10mmol/L），定溶至100mL，灭菌后存于4℃；

—溶液II：

现用现配，每100μL需要2mol/LNaOH10μL（0.2mol/L），10%SDS10μL（1%），然后加80μL无菌水；

—溶液III：

每100mL称取KAc49.1g,于70mL去离子水中溶解，然后加入冰乙酸11.5mL，定溶至100mL后，灭菌存于4℃；

—TE（pH8.0）：

每100mL取1mol/LTris-HCl（pH8.0）储液1mL（10mmol/L），0.5mol/LEDTA（pH8.0）0.2mL（1mmol/L），定溶至100mL后，灭菌存于4℃；

—无DNase的RNaseA：

将RNaseA溶于10mmol/LTris-HCl（pH7.5）,15mmol/LNaCl中，使终浓度为10mg/mL,于100℃加热15分钟，缓慢冷至室温，然后存于-20℃；

—Tris饱和酚（pH8.0）；

—氯仿/异戊醇（24：

1）；

—100%乙醇与70%乙醇，均于-20℃存放；

—1.5mLEp管，200μL及1mL枪头，灭菌；

—40μL，200μL，1mL加样枪；

—滤纸，1.5mLEp管；

—冰；

1．接种一单菌落于3mL含相应抗生素的培养试管中，于37℃剧烈振荡培养过夜；

2．将全部培养物分两次倒入1.5mLEp管中,12000g离心1min收集细胞;

3．将Ep管倒置于一干净滤纸上，将培养基尽可能流尽；

4．将细菌沉淀重悬于200μl冰预冷的溶液I中，剧烈振荡使细菌沉淀分散；

5．加400μL新配制的溶液II，盖紧管口，轻柔的快速颠倒Ep管5～10次，然后将Ep管于冰上放置5min；

6．加300μL用冰预冷的溶液III，盖紧管口，将Ep管颠倒混合15次左右，然后将Ep管于冰上放置5min；

7．2℃，12000g离心5min，将上清转入另一Ep管，加等体积的酚/氯仿，振荡混匀，2℃，12000g离心5min；

8．吸出上清，再加等体积的氯仿抽提；

9．在吸出的上清中加入2倍体积冰冷的乙醇于室温沉淀2min；

10．2℃，12000g离心5min，倒出上清，沉淀用70%乙醇洗两次。

然后倒置于一滤纸上，让乙醇挥发干净；

11．高拷贝质粒溶于含5μLRNaseA的50μlTE中；低拷贝数质粒减半。

注意事项：

1．细菌培养时间不宜过长，一般以12~16h为宜，如果培养时间过长，培养物会非常粘稠，这会导致离心沉淀的困难；

2．一般细菌培养好以后，应该马上提取。

如果不能马上提取，于4℃存放时间不能过长；

2．加溶液I分散细菌沉淀比较关键，如果分散不好，将直接影响产率；

3．溶液I加入后，溶液会非常浑浊，加入溶液II颠倒几次后，溶液变清，打开管口，会发现溶液呈鼻涕样，加入溶液III颠倒后，会发现有沉淀物形成，该沉淀物位于溶液上层。

如果发现沉淀不能自动聚集，而是呈烂棉花状，且离心后不能沉到管底，则预示着实验的失败；

4．培养基的成分非常复杂，如果去除得不太干净，则有可能影响到后面的酶切效果；

5．乙醇必须去除干净，否则会造成电泳点样时上漂；但样品又不能干燥太久，否则有可能使得质粒DNA沉淀难于溶解在TE中。

6．SDS在低温下会析出结晶，因此配制溶液II时应先于60℃溶解；

7．如果一次要提多个样品，可以先一起配制溶液II，而后加入每管。

但配制时应略大于所需要的量；

附：

1．苯酚的平衡

—重蒸苯酚

—8-羟基喹啉

—水浴锅

—固体Tris

—50mmol/LTris-HCl（pH8.0）:

称取6.055gTris，溶于800mL蒸馏水中，用浓HCl调pH为8.0，定容到1L。

1．将重蒸酚于65℃水浴融化；

2．取100mL融化的重蒸酚于一250mL烧杯中，马上加至少等体积的蒸馏水，同时加入0.1%苯酚体积的8-羟基喹啉，然后加入少量的固体Tris，当Tris溶解后，可看到液面分层出现，加Tris用7.6～8.5的精密pH试纸调pH为8.0（待加入的Tris溶解充分后，停止搅拌，待分层完全出现后，再用pH试纸测上相的pH值）。

3．将上清吸出，加入100mL50mmol/LTris（pH8.0），充分搅拌后，测定上清的pH值。

如果不到8.0，则还需要调节。

4．将上清吸出，再加入100mL50mmol/LTris（pH8.0），充分搅拌后，吸出上清，但要在液面上保留一层液体。

倒入棕色瓶中，于4℃保存。

这样的饱和酚可以使用2个月。

如果超出2个月，则应倒入专用的盛装回收酚的棕色瓶中，再重新平衡。

注意：

1.酚有强烈的腐蚀性，所以操作时一定要小心，注意不能溢出或溅出，并且要戴手套。

如果不小心溅到皮肤上，用大量的水冲洗，切忌用乙醇！

！

2.由于酚的腐蚀性，所以不用pH计调pH值，只能用pH试纸。

3.Tris一定要溶解充分后，再测定pH值。

2．核酸样品中蛋白质的去除

—3mol/LNaAC（pH5.2）：

称取40.824gNaAc·3H2O或无水NaAc24.6g，溶于30mL水中，加HAc调pH至5.2，用水定溶至100mL（调pH时，愈到后面，愈应小心）。

然后灭菌存于4℃。

如果是浓缩RNA，还要用DEPC处理后再灭菌。

—枪头和管子：

根据纯化样品的不同而采取不同的处理方式，纯化DNA时只需灭菌，纯化RNA时则需要DEPC处理后再灭菌。

—Tris饱和酚（pH8.0）；

—氯仿/异戊醇（24：

1）；

—冻存于-20℃的无水乙醇和70%乙醇

1．在核酸样品中加入1/2样品体积的Tris饱和酚和1/2样品体积的氯仿/异戊醇，混匀后，于2℃，12000rpm离心5min，将上清转入一新管中，重复酚/氯仿抽提直至界面无可见的沉淀物为止。

2．加入1倍样品体积的氯仿/异戊醇，混合均匀后，于2℃，12000rpm离心5min，将上清转入另一新管。

3．加入1/10终体积的3mol/LNaAC（pH5.2），再加入2倍体积的冰冷的无水乙醇，于-20℃至少沉淀3h。

4．2℃，12000rpm离心15min。

沉淀用70%的乙醇表面润洗2次，将管倒置于一滤纸上，空气中干燥。

然后将样品溶于适量体积的溶剂中。

注意：

1．混匀方式要根据DNA和RNA而有所不同：

RNA混匀时，可以剧烈震荡，而DNA只能用手颠倒混匀。

2．吸取上清液应根据待纯化的样品是DNA还是RNA而有所不同：

DNA吸取要缓慢，RNA则可以不加注意。

3．所加乙醇的体积是以加了盐后的体积计算的。

4．如果待纯化的核酸样品量太少（<1µg）或样品太稀（<0.01µg/µl）,则所加乙醇的量应扩大到2.5～3倍。

3．核酸的浓缩

以上所述的去除核酸中的蛋白质后，再用乙醇沉淀即为核酸的浓缩。

如果核酸样品已经很纯，则沉淀时无必要加入醋酸盐；如果核酸样品中还有杂质需要去除，则还应加入醋酸盐（NaAc,KAc或NH4AC）。

4．高感受效率感受态细胞的制备

—E.coliJM109或其它菌种

—LB液体培养基

—50mL离心管

—LB固体培养基

—LB平板

—200μL枪头，1.5mLEp管，灭菌；

—42℃水浴；

—10μL，200μL加样枪；

—培养试管，灭菌；

—恒温摇床，恒温培养箱；

—菌液推棒；

—抗生素储液，本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类，氨卞青霉素（Amp）（储液，100mg/mL，溶于无菌水中，工作浓度100μg/mL，即每毫升培养基取1μL储液）；四环素（Tet）（储液，5mg/mL，先用1/2体积的乙醇溶解，再加入1/2体积的无菌水，工作浓度50μg/mL，即每毫升培养基取10μL储液。

储液全部于-20℃保存）；

—冰；

—SOB培养基（1L）;蛋白胨20g,酵母抽提物5g,NaCl0.58g,KCl0.38g,100×镁离子母液（每100mL含MgCl2·6H2O20.33g,MgSO4·7H2O24.65g）10mL。

用1mol/LNaOH调pH至7.0。

—SOC培养基：

SOB+20mmol葡萄糖（每100mLSOB培养基中加入50%的葡萄糖溶液720μL。

）

—0.5mol/LCaCl2：

7.35gCaCl2·2H2O溶于100mLddH2O中。

用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

—1mol/LKCl：

7.45gKCl溶于100mLddH2O中，高压灭菌。

—0.45mol/LMnCl2；8.9gMnCl2·4H2O溶于100mLddH2O中，高压灭菌。

—0.5mol/L（K-MES）：

9.76g2（-N-吗啡啉）乙磺酸溶于约80mLddH2O中，用KOH调pH为6.2，加水定容至100mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

分装后于-20oC保存。

—二甲基亚砜（DMSO）。

—TB缓冲液：

10mmol/LK-MES（pH6.2）（0.5mol/LK-MES（pH6.2）2mL）,45mmol/LMnCl2（0.45mol/LMnCl210mL,15mmol/LCaCl2（0.5mol/LCaCl23mL），250mmol/LKCl（1mol/LKCl25mL），ddH2O60mL。

（用上述已经灭菌的母液配制，容量瓶事先也应灭菌。

）

—超净工作台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机。

1．接种一环E.coliJM109于2mLSOB培养基中，37℃培养过夜；或者将低温下保存的E.coli解冻后，于LB平板上划线。

2．取0.5mL过夜培养物或挑一个单菌落于50mLSOB中，于18℃摇床中培养16-24h至OD600值达到0.6。

3．取出摇瓶置于冰浴中10min，转入50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃上清液，将菌体悬浮于16mL预冷的TB缓冲液中，再置于冰浴中10min后离心收集菌体。

4．将菌体重新悬浮于4mLTB缓冲液中，加入280µLDMSO使其终浓度为7%，并轻轻摇匀，冰浴至少10min，将感受态细胞分装入EP管中并置于液氮中冷冻5min以上（此时的感受态细胞可于液氮中保存40天以上而不影响转化频率）。

5．取出EP管让其在冰浴上自然解冻，取200µL解冻的感受态细胞与1-10µLDNA混合，冰浴30min后，于42℃热冲击60s，立即置于冰浴中，5min后进行下一步。

注意：

从液氮中取出的EP管应迅速打开盖子，否则EP管可能爆裂伤人！

6．向热冲击后的EP管中加入0.8mL的SOC培养基，使总体积为1mL，37℃温和震荡（200rpm左右）培养1h；

7．将复苏的培养物倒入一Ep管中，4℃，4000rpm离心10min，将培养基倒掉，用残留的培养基悬浮，然后用加样枪将菌液加到LB平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30min后，倒置培养过夜。