Choosing the Right Tool for the Job.docx

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RNAi,TALEN,orCRISPR

选择一个恰当的方式：

RNAi，TALEN,CRISPR

摘要：

研究基因功能最常见的方法是减少或阻断基因的正常表达。

十多年来，RNAi一直是这一领域的王者，它提供了一个奇妙的方法来阻断许多生物的基因的表达。

然而随着新技术的涌现（尤其是CRISPR技术），正逐渐瓦解RNAi在哺乳动物细胞研究中的统治地位。

日新月异的技术发展也给研究者们带来了一个问题，“到底应该在实验中选择那一种技术呢？

”这篇文章就是通过比较和对比这些技术而形成的一篇指导性文章。

引言：

人类基因组计划测序的成功（Landeretal.,2001），给人们提供了关于人类的基本内在作用方式的全新的深入了解，也使得人们向治愈大多数疾病迈进了一大步。

在其完成了的15年多后，生物学家仍在继续致力于把攻坚于大量的基因组序列编码的成千上万的未知功能的基因（Birneyetal.,2007）。

基因组测序是一个惊人的挑战，但是，具有广大的前景，而且只是最初的一小步。

最困难的挑战摆在面前：

破译3.3亿DNA碱基对隐藏的意义，通过设定成千上万的基因的功能来说明它们是怎样一起作用使我们之所以成为人类的。

这是一个伟大的生物学承诺，但还尚未实现，随着最近新的生物学技术的发展，最大的发现还在后面。

破译基因功能的金标准就是阻断正常的基因表达和研究其产生的表型。

这种功能失活实验从ThomasMorgan发现了基因位于染色体上而且携带导致变异表型的突变基因开始，已经运用了100多年，在此基础上，数代科学家们致力于用基因突变、化学物质、放射线和病毒整合来映射每一个表型到相应的特异突变基因。

这种正向遗传学方法已经被运用了数十年，由于技术上充满了许多挑战（技术上的限制），使得这个过程（试图随机映射和在基因组DNA海洋里的表面上微小病变都）复杂化了。

人类基因组的测序提供了一张图，通过这张图，基因的功能可以被破译，但是它缺少方法来有选择地阻断特异基因以非随机的方式。

RNAi是被FireandMello发现的，它提供了靶向作用一个基因的神奇的突破口，使得研究者（通过反向遗传学）了解了DNA序列。

这项发现的时间是最好不过的了，而且在人类基因组序列可以免费获取之后，它作为一种方法很快就发表了。

FireandMello的工作震惊了科学界，他们展示了一个双链RNA简单的注射进入C.线虫（秀丽新小杆线虫），可以强有力地沉默任一基因序列而且产生相应的表型来揭示基因的功能（Fireetal.,1998）。

当RNAi的作用机制被发表以后，它很快就被应用到人类细胞中来抑制特异的基因（Elbashiretal.,2001）。

它使用的便易使得RNAi这种方法成为了人们破译基因功能的一个选择。

然而，RNAi也会产生亚等位基因表型，这种表型并不能反映完全的基因失活，这可能出现在基因突变中。

这个和其他实验鼓励了科学家对于反向遗传学的新的技术的探索。

随着锌指核酸酶（ZFNs）和随后的转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的发现（Gajetal.,2013），功能完全失活的反向遗传学方式变成了可能。

这种方法利用定制DNA结合结构域（DBDs），（DBDs被设计用来识别特异的靶向DNA序列），和核酸酶融合，DBDs可以用来引入DNA双链断裂（DSBs）和序列框移突变到基因中，这可以导致它们的敲除（Sungetal.,2013）。

一个最新的和难以置信的强有力的新增的基因组编辑方法就是CRISPR/Cas系统。

它涉及了细菌对抗病毒感染（传染）（是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御），最初是在嗜热链球菌中被提及的（Barrangouetal.,2007）。

最近，从化脓链球菌中提取的II型CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于CRISPR系统中而且成功编辑了人类基因组（Choetal.,2013;Congetal.,2013;Jineketal.,2013;Malietal.,2013c）。

CRISPR/Cas系统的整个发现和发展的历程在以前已经得到了极好的描述（DoudnaandCharpentier,2014）。

总而言之，这些有力的方法为迅速有效地破译基因的功能提供了一个新的可能。

随着不断增加的关于基因失活实验的分子方法的发现，许多研究者就出现了关于选择一个最佳方法的问题。

本篇综述就是基于通过比较和对比这些奇异的新的方法的总结（表一Table1），而且给研究者提供了一个“实验指导”来决定怎样来揭示细胞中的基因的功能。

你应该选择哪一个呢？

正文：

RNAi

RNAi是一种目前运用于反向遗传学最广泛的方法，用以研究哺乳动物细胞中的基因的功能。

它的成功可以归因于进化上保守的内源性信号通路，这个信号通路通过小RNAs调节基因表达（WilsonandDoudna,2013）。

内源性的RNAi可以通过引入合成的小RNA进入细胞得以调控，常使用小干扰RNA（siRNA）或小的发夹RNAs（shRNAs）（Mohretal.,2014）。

这些方法所产生的结果是一样的，所以引入的RNA结合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）上，这个复合体进而促进完全互补的靶向mRNA的降解（图1A）（CarthewandSontheimer,2009）。

使用这一方法，可以减少转录后的靶向mRNA和其后的靶向蛋白质水平。

然而，由于RNAi的活性形式通常是在细胞质，细胞核中的转录--例如长链非编码RNA（IncRNAs）--就可能很难得以靶向作用（Derrienetal.,2012;FaticaandBozzoni,2014）。

此外，最近的研究显示IncRNA本身的转录就可以产生有功能的结果（Kornienkoetal.,2013）。

因此，通过RNAi减少IncRNAs的转录后水平可能并不能揭露出他们完全基因失活的表型（Bassettetal.,2014）。

RNAi的一个主要的优势在于沉默机制广泛存在于哺乳动物的体细胞中。

因此，靶细胞系中没有一个优先的遗传处理是必须的，而且一个单一的siRNA转染会导致一个功能失活的表型。

SpecificityandOff-TargetEffectsofRNAi（RNAi的特异性和脱靶效应）

（脱靶效应：

RNA干扰过程中，siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。

但研究证实，siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，这种现象称为siRNA脱靶效应。

）

自从RNAi被发现以来，在使用RNAi作为研究基因功能一种方法时，人们也越来越关注脱靶效应。

已经有发现siRNAs可以通过有限的序列互补性诱导非靶向mRNAs的沉默，这主要是因为通过与3’UTR（3’非编码区）相互作用（CarthewandSontheimer,2009）。

当3’UTR的短链区域存在与小RNA存在不完全配对时，这种相互作用就会出现，并引发转录抑制和/或降解（Jacksonetal.,2006;SigoillotandKing,2011）。

通过这种基于序列的方式，一个siRNA可能可以抑制成百上千的转录子（SigoillotandKing,2011）。

这些脱靶效应似乎是与剂量有关（Wangetal.,2009），而且来源于它们的表型相较于预期的正确的表型占优势（Franceschinietal.,2014）。

除了序列特异性脱靶效应之外，siRNAs和shRNAs人为引入到靶细胞系中也可以引起非系列特异的脱靶效应。

正如前面所说的，RNAi通过天然的信号转导通路来调节细胞的基因表达水平，这些信号转导通路系统是由内源性microRNAs调控的。

通过外源序列来flooding可以取代RISC中的microRNAs，就可以破坏内源的microRNA的功能，引起基因水平的改变和脱靶效应表型的出现（Khanetal.,2009）。

（flooding是指从任何节点发送信息给与之相连的所有其他节点。

）正是这些发现推动了人们致力于开发可替换的反向遗传学方法。

TranscriptionActivator-LikeEffector（转录激活样效应器）

随着可编辑的DNA结合蛋白质--转录激活样效应器（TALEs）的发展，一个从根本上不同的调节基因功能的方法成为了可能。

这个方法利用了合成的转录因子DBDs（DBDs识别特异的DNA模体）。

TALEDBDs包含有7-34个高度同源的直接重复序列，每一个重复序列由33-35个氨基酸组成。

其特异性的关键在于每一个重复序列的12位和13位的2个氨基酸残基，被称为重复多变残基（RVD）（JoungandSander,2013）。

由于RVDs的蛋白结合密码子已经被破译（Bochetal.,2009;MoscouandBogdanove,2009），这使得设计TALEs成为了可能，TALEs通过设计一个合适的DBD来沉默任意想要的靶向DNA序列。

通常，TALEs被设计用来识别15-20个DNA碱基对，平衡伴随有脱靶效应的特异性（Milleretal.,2011;Mussolinoetal.,2011）。

这种方法是针对基因组中每一个独特的靶位点，所以需要设计不同的DBDs，每一个DBD由500-700个氨基酸组成，这是一个很冗长的过程。

在最近数年里，TALEs的固有的可编辑性被用来执行大量的功能，仅仅通过把各种各样的效应结构域与DBD融合即可。

TALETranscriptionalRepressor（TALE转录抑制子）

基因沉默借助于KRAB-TALEs达到转录抑制，在KRAB-TALEs中，转录抑制子Kru¨ppel-associatedbox（KRAB）结构域和DBDs融合，从而靶向作用于转录起始位点（TSS）（Congetal.,2012）（Figure1B）（KRAB结构域为一蛋白质-蛋白质相互作用区,可以与多种协同转录抑制因子和转录因子结合）。

和RNAi相比，这种方法的一个关键的不同就在于TALE抑制物阻碍了细胞核中靶基因的转录，而RNAi只能于转录后在细胞质中降低它们。

这就允许了，例如源于每一个转录序列的功能效应的研究，正如最近对于IncRNAs的描述（Bassettetal.,2014）。

另一方面，TALE抑制物模仿了RNAi的亚等位基因效应，如此一来，基因的功能就被抑制了但并不是永久性地破坏，这就是TALENs的实例。

TALEN

TALEDBDs也成功地应用于了哺乳动物突变基因的研究。

在这个策略下，将TALEDBDs和核酸酶效应器结构域如Fokl（非特异性核酸内切酶）融合在一起，就形成了TALEN（Gajetal.,2013）。

FokI只有在二聚体的形式下才具有活性；如此，TALENs结合于Fokl核酸酶结构域临近的基因组靶位点，在这里，他们造成了DNA双链断裂（DSBs）（Figure1C）。

尽管在这个策略中，由于只有在Fokl正确定位和二聚化之后，DSB才会出现，每一个靶位点需要两个TALENs结构，其极大的特异性就是这样实现的（Christianetal.,2010）。

一旦出现了DSB，DNA就可以通过两个不同的机制得以修复：

高度精确的同源重组修复（HRR）和易出错的非同源末端连接体（NHEJ）（ValerieandPovirk,2003）。

通过NHEJ的DSBs的修复时常出现DNA靶位点的删除，插入或替代（Duraietal.,2005）。

在TALEN技术中，这就是想要得到的，而且使用者大多通常将TALEN靶向作用于5’基因的外显子，促进早期框移突变或提早终止编码。

由于存在着永久性的基因损害，所以一旦突变被引入，就没有必要再持续TALEN活性进入靶细胞。

这和RNAi的可逆性质形成了对比，在TALEN中小RNA的丢失相当于其所诱导的表型的丢失。

除了可以通过NHEJ引入随机阅读框突变，TALENs也可以用来引入非随机的目的突变，靶向删除，或通过上述的HRR添加长DNA片段。

在过去，哺乳动物细胞基因组的编辑最初是通过引入包含有靶位点的同源序列的捐赠者的DNA。

然而这种过程对于哺乳动物的细胞作用效率非常低（Vasquezetal.,2001）。

最近发现，通过同源重组在合适的捐献者DNA中引入DNADSBs增加了基因编辑的效率（Moehleetal.,2007）.由于靶向的DSBs可以很容易通过TALENs引入DNA，这样的DSBs的重组和捐赠者的DNA修复模板的同源序列的转染变成了一个很受欢迎的方法，用以精确设计哺乳动物基因组，详细内容见（Gajetal.（2013）。

SpecificityandOff-TargetEffectsofTALENTechnologies（TALEN技术的特异性和脱靶效应）

由于Fokl是TALEN技术的必需物质，只有在二聚体形式下才具有核酸酶活性，没有单一的TALEN曾经引入了DSB到靶位点。

因此，两个TALEN必须脱靶临近位点来引入一个非特异性的DSB到DNA中。

因此，从TALEN中观测到的脱靶效应通常较低（Guilingeretal.,2014a;Hockemeyeretal.,2011;Mussolinoetal.,2011）。

和TALENs不同，TALE转录抑制子以单体的形式发挥作用，而且可以自主地调节脱靶效应。

ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats（CRISPR）

Cas9:

AnRNAGuidedDNAEndonuclease

成簇的、规律间隔的短回文重复序列

Cas9:

一个RNA引导的DNA核酸内切酶

和TALENs相似，CRISPR相关蛋白9（Cas9）也是一个可以编辑的DNA核酸酶。

然而，它的运行模式有几方面的不同：

首先，Cas9拥有固有的核酸酶活性。

这个酶的活性形式是单体，而且可以催化DSBs（Hsuetal.,2014）,因此，和TALENs对靶向作用于同一个位点相似，一个单体Cas9分子靶向作用于基因的上游外显子通过DSBs和NHEJ修复生成随机敲除表型。

和TALENs一样，要想实现一个基因的完全敲除，靶基因的每一个具有功能的拷贝都需要被阻断。

在部分成功的细胞编辑中，通常观察到大约转导后5-8天效应达到最大（Hsuetal.,2014）。

迄今为止，通过SURVEYOR试验定量，最高的效率高达50%（Hsuetal.,2013;Malietal.,2013c）。

即使在近乎单一的细胞系KBM7中，最大的编辑效率据报导是70%（Wangetal.,2014）。

因此，为了得到关于感兴趣的靶基因的纯合子敲除细胞系，通常有必要筛选几种克隆细胞系用于纯合子基因的阻断（Ranetal.,2013b）。

另一个TALENs和Cas9主要的不同在于蛋白质识别其基因组靶位点的方式。

TALENs编码DNA靶向模体特异性在于其DBD的氨基酸序列，Cas9则需要一个单一引导RNA嵌合体（shRNA）（Figure2A）。

所以，对于TALENs，其DBD的氨基酸序列对于每一个靶向位点都必须重新设计，而一个不变的Cas9核酸酶可以靶向作用于大量的特异性靶向位点sgRNA。

这是其可编辑性使得CRISPR/Cas9平台迅速地取代了其他基因编辑方法，包括ZFNs和TALENs。

II型CRISPR/Cas9系统可从化脓链球菌得到，是目前运用于研究哺乳动物细胞系中基因组编辑的最受欢迎的方法。

sgRNA由两个分开表达的RNAs，一个CRISPRRNA（crRNA）和一个反式激活crRNA（tracrRNA）组成，通过细菌的内源性的sgRNA加工处理成成熟的gRNA（Chylinskietal.,2014;Deltchevaetal.,2011）。

随后，据数据显示，表达一个嵌合sgRNA是有可能的，这个嵌合sgRNA由crRNA,和tracrRNA融合形成，可以在体外表现为一个成熟的sgRNA，而不需要进一步的处理（Jineketal.,2012）。

嵌合型的sgRNA和经过充分处理的天然细菌的sgRNA相似，由一个调节与Cas9相互作用的保守的序列和一个调节与基因靶位点相互作用的可变序列组成。

嵌合sgRNA目前应用于含有17-20nt长的可变区的基因的编辑，这个可变区和基因靶向序列互补。

最近，有人设计了一个改良的嵌合sgRNA来挣钱它的表达和与Cas9的相互作用。

为此，一个潜在的PolIII终止子从sgRNA的恒定区域被移到了一个延伸的5bp发架结构，以此来恢复化脓性链球菌的发架结构（Deltchevaetal.,2011）。

重要的，Cas9的一个主要特异性决定因素是前间区序列临近基序（PAM）。

PAM是一个靶向序列3’的一个短片段。

这个PAM有一个NGG序列，可以与从化脓链球菌中得到的Cas9相互作用，而不和从不同物种中的得到的Cas9蛋白相互作用（Horvathetal.,2008）。

正交的PAM包含有NGGNG（Horvathetal.,2008），NAAR（vanderPloeg,2009）和NNAGAAW（Deveauetal.,2008）。

尽管由于需依赖PAM限制了Cas9的靶向作用空间，但是正如后面即将提及的，它提供了特异性的另外一个水平--脱靶效应部分。

CRISPRInterference（CRISPR干扰）

可以编辑Cas9结合基因组的特异区域促使机组人开发转录抑制。

和TALE转录抑制剂相似，把一个酶活性不高的Cas9（deadCas9ordCas9）融合到一个抑制剂结构域中（例如KRAB），就可以触发位于TSS的异染色质，调节基因沉默（Qietal.,2013）（Figure2B）。

这种方式就叫做CRISPRi（Gilbertetal.,2013）。

和TALE转录抑制相似，它可以引起靶mRNA的转录减少。

和RNAi相比，在相同数量的RNAs效应器的情况下，CRISPR干扰（CRISPRi）似乎可以产生更多连续的，有效的基因敲降。

例如，6/8的sgRNA被发现可以抑制GFP至少75%的水平（Gilbertetal.,2013），通过与RNAi的一个直接比较，使用CRISPRi方法显示出了一个显著的更强的基因失活表型（Gilbertetal.,2014）。

和其他技术一样，CRISPRi有它的注意事项。

和RNAi形似，我们仍然缺乏一个扎实的了解关于通过给予一个sgRNA可以保证靶位点是活跃的相关的规则。

我们确实知道TSS的获取和定位是关键：

Cas9需要在物理上接近其靶位点。

。

这个过程依赖染色质的可达性（Kuscuetal.,2014;Wuetal.,2014）。

因此，处于闭合染色质状态的基因区域可能阻碍其结合，进而阻碍Cas9的功能。

想要获得最大效率的转录抑制，KRAB结构域应该靶向结合一个位点，这个位点位于TSS下游的500bp（Gilbertetal.,2014）。

因此，知道靶向转录子的TSS定位非常重要。

重要的是，即使在全基因组序列中，如人类基因组，一些TSSs在实验上可能很难得以注释，如miRNATSSs（Georgakilasetal.,2014）。

此外，许多基因有可替换的转录子，一些转录子和TSS相隔甚远。

这些TSS的用法在不同的细胞类型之间可以不同（Sandelinetal.,2007），所以，对于被给予的细胞类型，靶向作用于正确的TSS很重要。

此外，不同的转录变异体可替换的TSSs同时表达可以产生多余的行动（Davulurietal.,2008）。

所以，在一个细胞中，如果多个转录子变异体表达，阻碍一个特异TSSs中的一个转录子可能不足以产生一个功能失活的表型。

当不同的转录子共用一个TSS时一个不一样的问题出来了，通常这种情况出现在内含子非编码RNAs中（Heetal.,2012）。

dCas9-KRAB靶向作用于这样的TSSs可能阻碍所有的相关转录子的转录。

观察的基因敲降表型归因于其中一个转录子还是另一个？

因此就需要额外的实验来确定。

CRISPRActivation（CRISPR激活）

哺乳动物细胞的功能添加研究在习惯上用过表达转基因开放阅读框架（ORFsorcDNAs）到靶细胞中。

这种方法涉及一个在启动子之后的ORF并把它导入靶细胞中。

最近，CRISPR方法被应用于基因的表达从内源性基因定位，这绕过了细胞中靶ORFs的再三克隆和表达。

至今，几个dCas9-based方式已经成功运用于哺乳动物细胞的转录激活（Chengetal.,2013;Farzadfardetal.,2013;Maederetal.,2013;Malietal.,2013a;Perez-Pineraetal.,2013）。

所有的方法都依赖于转录激活结构域靶向作用于基因的TSSs；最常见的有VP64（Beerlietal.,1998）就融合到了dCas9（Figure2C）。

在许多研究中已经显示出，只有当dCas9-VP64蛋白质共表达并伴随着许多（3/5）sgRNAs靶向作用于同一个TSS时，dCas9-VP64蛋白质才可以有效地激活内源基因的转录（Chengetal.,2013;Maederetal.,2013;Malietal.,2013a;Perez-Pineraetal.,2013）。

为了克服这一限制，最近提出了一些新的策略（Chavezetal.,2015;Konermannetal.,2015;Tanenbaumetal.,2014）。

所有的方法说明只有当每个细胞只有一个sgRNA表达时，内源基因才能达到有效的激活。

和CRISPRi相似，靶位点是CRISPR激活（CRISPRa）获得最大激活效率的关键：

TSS上游（-400---50nt）区域通常被视为CRISPRasgRNAs最佳的靶位点（Gilbertetal.,2014;Konermannetal.,2015）。

这和CRISPRi的靶向TSS（0--500nt）下游位点是相互隔开的。

。

CRISPRa依赖于靶向转录子的TSS，这意味着它所面临的挑战和上述的CRISPRi所面临的相似。

最重要的，TSS的定位对于有效激活是必不可少的，其次，来源于一个TSS和相同的TSS的大量转录子的激活不能单个地被抑制。

RNAPolymerasePromotersforsgRNAExpression（关于sgRNA表达的RNA聚合酶启动子）

大量的研究用III型聚合酶启动子（U6，H1，7SK和RNA启动子）来转录sgRNA，赋予其转录小RNAs较高水平天然属性。

在一些文章中，可能有用到II型聚合酶启动子来表达sgRNA。

例如，通过使用细胞特异类型启动子就可以实现组织特异表达。

然而，使用II型聚合酶启动子使得表达功能性的sgRNAs更复杂化，赋予加盖的多聚腺苷酸RNAs一条自然通路以作为一个mRNA通过核糖体往返穿梭。

为了克服这一问题，Nissimetal.（2014）研制出一些方法以允许从人体RNA-II型聚合酶启动子得到的单个（或）和多个sgRNAs的表达。

，允许CRISPRi和CRIS