吴茱萸次碱衍生物的合成及抑菌活性.docx

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吴茱萸次碱衍生物的合成及抑菌活性

吴茱萸次碱衍生物的合成及抑菌活性

郭现翠1，王奇志2，徐曙2，单宇2，印敏2，冯煦2，罗金岳1*，刘飞2*

（1.南京林业大学化学工程学院，江苏南京210037；2.江苏省中国科学院植物研究所（南京中山植物园），江苏南京210014）

摘要：

以吴茱萸次碱为原料，通过硫代反应等以54.5%-87.6%的收率合成了硫代吴茱萸次碱及其5种N-取代衍生物（Ⅱ、Ⅳa~e），采用HRMS、FTIR、1HNMR和13CNMR对产物进行了结构表征；分析了10μg/mL的样品对9种植物病原菌的抑菌活性。

结果表明：

合成的六种化合物（Ⅱ、Ⅳa~e）对植物病原真菌几乎没有抑制作用，化合物Ⅳa、Ⅳb及Ⅳd对细菌（水稻白叶枯病菌，Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Ishiyama））具有较明显的抑菌活性，其中N-苄基硫代吴茱萸次碱（Ⅳb）和N-（4-甲基苄基）-硫代吴茱萸次碱（Ⅳd）的抑制率分别为81.84%和59.95%。

通过细胞毒活性实验发现合成的化合物（Ⅱ、Ⅳa~e）对人体正常细胞（人肺成纤维细胞，HFL1）几乎没有毒性（IC50>80μmol/L）。

关键词：

吴茱萸次碱；硫代吴茱萸次碱；抑菌活性；农药

中图分类号：

TQ455.47，O629.3文献标识码：

A

SynthesisandAntifungalActivityofRutaecarpineDerivatives

GUOXian-cui1,WANGQi-zhi2,XUShu2,SHANYu2,YINMin2,FENGXu2,LUOJin-yue1*,LIUFei2*

（1.CollegeofChemicalEngineering,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China;

2.InstituteofBotany,JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences,NanjingBotanicalGardenMem.SunYat-Sen,Nanjing210014,China）

Abstract:

InordertostudyanddeveloptheindolequinazolinealkaloidofthetraditionalChinesemedicineevodia,thethiorutaecarpineandfiveN-substitutedderivativesweresynthesizedfromrutaecarpinebythionation.ThestructuresoftheproductswereconfirmedbyHPLC-HRMS,IR,1HNMRand13CNMR.Theantifungalactivityonnineplantpathogensofthecompounds（ⅡandⅣa~e,10μg/mL）wasanalyzed,anditwasfoundthattherewasalmostnoinhibitoryeffectontheplantpathogenicfungi,andN-substitutedthiorutaecarpine（Ⅳa,ⅣbandⅣd）hadobviousantifungalactivityagainstbacteria[Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Ishiyama）].TheinhibitoryratesofN-benzylsulfo-rutaecarpine（Ⅳb）andN-（4-methylbenzyl）sulfo-rutaecarpine（Ⅳd）were81.84%and59.95%,respectively.Therutaecarpinederivativeswerefoundtobealmostnon-toxic（IC50>80μmol/L）tohumannormalcells（HFL1）bycytotoxicityassay.

Keywords:

rutaecarpine;sulfo-rutaecarpine;antifungalactivity;pesticides

Foundationitems:

National Natural Science Foundation of China （No:

 31570359 and 31470425）;

DevelopmentProjectsfromtheScienceandTechnologyFoundationofJiangsuProvince（Grantnumber:

BE2016753）;JiangsuKeyLaboratoryfortheResearchandUti1izationofPlantResources（SQ201402）

在现代农业生产中，农药占据着不可替代的位置。

农药不仅用于防治病虫害、杂草以及各种病原菌等引起的农业生物灾害，而且在促进农业增产方面发挥着重要的作用。

但是过量、不合理使用化学农药，不仅易使有害生物产生抗性，而且易造成农产品质量安全危害，同时大量有毒有害物质残留于土壤、水体和空气中，造成严重的环境污染问题[1-2]。

植物源农药是从植物中提取有杀虫或抗菌等作用的活性物质，直接或间接加工获得的农药[3]。

从植物中寻找结构新颖、作用机理独特的农用活性先导化合物，对其化学结构进行优化，从中发现更高活性的化合物，是创制新农药的一条重要途径[4]。

植物源农药具有在环境中生物降解快，多靶点且靶标特殊，对人畜及对非靶标生物毒性低，活性成分作用机制独特，不易产生抗药性等特点[5-7],符合现代农业环保、健康、持续发展的时代要求，越来越受到重视[8-9]。

天然产物是药物的一个重要组成部分，发现有生物活性的先导化合物，是创新药物研究的重要前提。

吴茱萸（Evodiarutaecarpa）是芸香科落叶灌木或小乔木植物吴茱萸[Evodiarutaecarpa.（Juss.）Benth]、石虎[Evodiarutaecarpa.（Jess.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang]或梳毛吴茱萸[Evodiarutaecarpa.（Jess.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang]的干燥近成熟果实，是一种传统中药，其生物碱成分具有多种生物活性[10-11]。

国内左国营[12]等研究发现吴茱萸中提取的吲哚喹唑啉生物碱（如吴茱萸次碱，化合物Ⅰ）是一类有抗真菌活性的植保素，具有显著的抗稻瘟病菌作用，并初步分析了构效关系。

国外Lee[13]等发现吴茱萸次碱是一种可以从多种医药植物中提取到的生物碱，具有广泛的生理活性，如抗癌、抗痢疾、杀虫、杀菌、消炎以及体温调节等作用[14-18]。

本课题组的王奇志[10,19]等从吴茱萸中分离得到了十余种吲哚喹唑啉生物碱，研究了其抗肿瘤、抗菌等活性；本课题组前期针对吴茱萸碱、吴茱萸次碱等吲哚喹唑啉生物碱的结构修饰发现，吲哚N原子位置的修饰可以提高其抗肿瘤、抑菌活性。

近年来，有机硫类化合物因其具有特殊的化学结构，且具有相对于有机磷类的低毒性，而受到关注[20-21]。

本文以吴茱萸次碱为原料，通过硫代反应合成硫代吴茱萸次碱及其5种N-取代衍生物，研究其对植物病原菌的抑菌活性，为吴茱萸吲哚喹唑啉生物碱在农业中的应用提供借鉴。

1实验部分

1.1实验试剂与仪器

溴代异丁烷、对甲基苄溴、溴化苄、石油醚（PE）、乙酸乙酯（EtOAc）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、 二氯甲烷（CH2Cl2），国药集团化学试剂有限公司；吴茱萸次碱，南京春秋生物工程有限公司；劳森试剂（Lawesson’sreagent，2,4-双（4-甲氧苯基）-1,3-二硫代-2,4-二磷-2,4-硫醚），北京百灵威科技有限公司；1,5-二溴戊烷、碘代正丁烷，上海晶纯生化科技股份有限公司；NaH，天津市化学试剂研究所；NaCl，南京化学试剂有限公司；Na2SO4，西陇化工股份有限公司；CaCl2，上海久亿化学试剂有限公司；二甲亚砜（DMSO），成都市科龙化工试剂厂； MTT[3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基溴化四唑]，Biosharp公司。

以上试剂均为AR。

85-Ⅱ型恒温加热磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；ZNHW-Ⅱ恒温控制仪，郑州长城科工贸易有限公司；METTLERAE240分析天平，梅特勒-托利多仪器公司；RE-3000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Aglient1260-6500Q-TOF液质联用仪，美国Aglient公司；Nicolet380FTIR红外光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；Bruker300MHz及Bruker500MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Thermo-6500CO2培养箱，美国Thermo公司；ThermoNapflow超净工作台，美国Thermo公司；InfiniteM200酶标仪，瑞士TECAN公司；MS3digital定时微量振荡器，德国IKA公司。

1.2实验方法

1.2.1硫代吴茱萸次碱及其衍生物的合成

1.2.1.1硫代吴茱萸次碱（化合物Ⅱ）的合成

在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，分别加入吴茱萸次碱（0.50g，3.50mmol），劳森试剂（以100mL甲苯溶解），于110℃下搅拌反应6h，薄层色谱（展开剂V（PE）:

V（EtOAc）=5:

1）监测反应。

反应结束后旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析（洗脱条件V（PE）:

V（EtOAc）=2:

1）分离纯化得到产物，结构如下所示：

计算收率。

产物收率按下式计算：

产物收率/%=

式中，m1为产物的理论产量，g；m0为分离纯化后产物得到的产物质量，g。

1.2.1.2N-取代硫代吴茱萸次碱（化合物Ⅳa~e）的合成

化合物Ⅳa和Ⅳb的合成：

按照1.2.1.1合成硫代吴茱萸次碱，在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入硫代吴茱萸次碱（0.20g，0.66mmol）、NaH及DMF（10mL，4Å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烃（0.99mmol）。

50℃下搅拌反应，薄层色谱监测反应。

反应结束后进行后处理：

加水（10mL）淬灭NaH，以乙酸乙酯萃取（20mL）三次，合并有机相，饱和食盐水洗涤两次，无水Na2SO4干燥2h，抽滤，旋转蒸发除去溶剂，硅胶柱层析分离纯化得到产物。

其反应方程式见SchemeA所示。

化合物Ⅳc、Ⅳd和Ⅳe的合成：

在配有温度计和冷凝管的三口烧瓶中，加入吴茱萸次碱（0.50g，3.50mmol）、NaH及DMF（20mL，4Å分子筛除水），室温下搅拌20min，缓慢加入卤代烷烃，80℃下搅拌反应，薄层色谱监测反应。

反应结束后按上述化合物Ⅳa和Ⅳb的合成进行后处理。

在甲苯（10mL）中，加入卤代烃取代的吴茱萸次碱（0.50mmol），加入劳森试剂，于110℃反应6h后，薄层色谱监测反应，硅胶柱层析分离得到纯净产物。

其反应方程式见SchemeB及SchemeC所示。

a-Lawesson'sreagent,methylbenzene,110℃;b-Ⅳa:

DMF,NaH,1-butyliodide;Ⅳb:

DMF,NaH,benzylbromide;c-Ⅲa:

DMF,NaH,1-bromo-2-methylpropane;Ⅲb:

DMF,NaH,p-Methylbenzylbromide

a-DMF,NaH,Br（CH2）5Br;b-Lawesson'sreagent,methylbenzene,110℃

1.2.2抑菌活性实验

采用菌丝生长速率法（真菌）以及浊度法（细菌）对9种植物病原菌进行室内毒力初步测定。

将各菌株在PDA（真菌）平板上或NB（细菌）培养液中活化培养，对于真菌，使用5mm口径的打孔器在菌落边缘打取菌碟，将供试杀菌剂用DMSO溶解制成母液（质量浓度为10000μg/mL），然后加入培养基中制成的硫代吴茱萸次碱及其衍生物终质量浓度为10μg/mL的PDA含药平板，将各病原菌菌碟接种至平板上，以等体积DMSO为对照，每个样品进行3次重复实验；对于细菌，将菌液稀释到一定浊度后加入硫代吴茱萸次碱及其衍生物终质量浓度为10μg/mL的NB液体培养基中，以无菌水为对照，每个处理3个重复；25℃培养箱培养至对照接近长满板（真菌）或28℃摇床摇培至对照对数生长期（细菌），十字交叉法测定菌落直径（真菌）或浊度仪测定浊度（细菌），并计算抑制率。

以无菌水作为空白实验（溶剂抑制率）。

其中抑制率按下式计算：

菌落直径/cm=菌落直径平均值﹣0.5（菌碟直径）

菌丝生长抑制率（%）=（对照菌落生长直径﹣处理菌落生长直径）/对照菌落生长直径×100。

1.3产品结构鉴定方法

对得到的吴茱萸次碱衍生物以液质联用、红外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱进行分析及结构鉴定。

液质联用仪条件[22]：

二极管阵列检测器DAD190~400nm，色谱柱：

ZorbaxSB-C18柱，4.6×100mm，1.8μm，含0.1%甲酸的H2O为流动相A，CH3OH为流动相B，洗脱条件：

0~15min，流动相B70%~100%，15~30min，流动相B100%，流速：

0.3mL/min，柱温35℃；色谱柱流出组分进入电喷雾质谱仪的流速为10μL/min，正离子质谱（ESI+/MS）条件：

毛细管电压：

4.0kV，干燥气温度：

350℃，雾化器压力：

3.4×105Pa，化合物纯度测定：

紫外检测波长取254nm，面积归一法定量；IR：

溴化钾压片；1HNMR（300MHz或500MHz）及13CNMR谱（75MHz或125MHz，CDCl3为溶剂，四甲基硅烷（TMS）做内标。

1.4细胞毒活性测试

对合成的吴茱萸次碱衍生物采用MTT法对人体正常细胞（HFL1）进行细胞毒性测试的体外实验。

将人体正常细胞（HFL1）接种于96孔培养板上，密度为每孔100μL含有细胞5000个，培养过夜，次日用质量浓度为100μg/mL的待测样品进行处理，在温度为37℃、V（CO2）=5%的培养箱中孵育。

72h后，向各孔中加入10μLMTT（5mg/mL，PBS），继续在培养箱中孵育，4h后，每孔加入100μLDMSO，振摇5min，用酶标仪在波长570nm的条件下测定每孔的吸光度并按下式计算细胞生长抑制率：

抑制率/%=（A对照组-A用药组）/（A对照组-A调零孔）×100。

式中，A为吸光度。

阳性对照为紫杉醇，浓度为0.1mmol/L。

设置5个浓度梯度：

20、10、5、2.5、1.25μg/mL，同上法检测吸光度。

采用改良寇氏法计算IC50值，计算公式为：

IC50=lg1[Xm-i（∑P-0.5）]。

式中，Xm为设计的最大的浓度的对数值；i为相邻两组浓度对数值；∑P为各组生长抑制率之和，%；0.5为经验常数。

2结果与讨论

2.1吴茱萸次碱衍生物的合成

以吴茱萸次碱为原料合成硫代吴茱萸次碱衍生物过程中，涉及以劳森试剂为底物的硫代反应及吴茱萸次碱衍生物的N-取代反应。

首先对这两个反应进行了初步的工艺优化。

以硫代吴茱萸次碱（化合物Ⅱ）的合成为例，考察了劳森试剂物质的量对硫代吴茱萸次碱及其衍生物收率的影响，结果见表1。

表1劳森试剂的物质的量对产物收率的影响

Fig.1EffectofmoleratioofLawesson’sreagentandrutaecarpineontheyield

n（劳森试剂）/n（吴茱萸次碱）

0.9

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

2.1

产物

（2）收率/％

32.4

39.7

45.2

54.5

53.5

54.0

54.3

如表1所示，当劳森试剂的物质的量不足时（n（劳森试剂）/n（吴茱萸次碱）=0.9），产物Ⅱ的分离收率较低，仅为32.4%；将劳森试剂的物质的量提高，产物的收率随之提高，当劳森试剂物质的量为吴茱萸次碱的1.5倍时，产物收率达到54.5%，薄层色谱分析发现此时仍有一定量的吴茱萸次碱未反应完全；进一步提高劳森试剂的物质的量，经薄层色谱分析发现，硅胶板经碘显色后，原料点与之前相比颜色变浅，产物点颜色深度几乎不变，且产物点附近又发现一新点，可以推断，未反应的吴茱萸次碱的量减少，但产物收率几乎不变，此时反应的副产物增加。

因此选定适宜的劳森试剂物质的量为吴茱萸次碱的1.5倍。

表2为NaH的物质的量对产物收率的影响。

如表2所示，以吴茱萸次碱与溴代异丁烷为反应底物（合成化合物Ⅲa），考察了NaH的物质的量对合成N-取代吴茱萸次碱衍生物反应的影响，当n（NaH）/n（吴茱萸次碱）=0.9，产物Ⅲa的分离收率仅为65.1%；提高NaH的物质的量，产物的收率明显提高，当NaH的物质的量为吴茱萸次碱的1.3倍时，产物收率达到最高，为82.0%；进一步提高NaH的物质的量，会造成产物的过度还原，产物会进一步脱氢，而产物收率不再增加。

通过液质联用分析发现，产物准分子离子峰为344（[M+H]+），脱氢产物准分子离子峰为342，增加NaH的物质的量时，在总离子流图中可见脱氢产物峰面积增加，即副产物——脱氢产物增加，产物收率不再增加。

因此选定适宜的NaH用量为吴茱萸次碱的物质的量的1.3倍。

表2NaH的物质的量对产物收率的影响

Fig.2EffectofmoleratioofNaHandrutaecarpineontheyield

n（NaH）/n（吴茱萸次碱）

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

产物（3a）收率/％

65.1

70.3

73.2

75.6

82.0

80.9

81.1

尝试两种方法合成了硫代吴茱萸次碱衍生物：

方法一（SchemeA，合成化合物Ⅳa和Ⅳb）中首先以劳森试剂进行硫代反应，再与卤代烃进行取代反应；方法二（图1，SchemeB及SchemeC，合成化合物Ⅳc、Ⅳd和Ⅳe）则与方法一相反，首先以吴茱萸次碱为原料，获得N-取代吴茱萸次碱，再与劳森试剂反应获得产物。

实验中发现：

方法一，硫代吴茱萸次碱（化合物Ⅱ）的分离提纯较困难（与吴茱萸次碱难以分离），但硫代吴茱萸次碱与卤代烃反应后较容易进行分离提纯；方法二的问题同样在于第二步反应（N-取代吴茱萸次碱与劳森试剂反应）后产物分离困难。

两种方法的困难之处都在于硫代产物难以分离，分析原因推测是由于碳和氧同属于第七主族，化学性质十分相似，碳硫键与碳氧键相比极性改变不大，且薄层色谱分析发现两者的Rf值相差小于0.1。

两种方法相比，不同产物的收率接近，均为可行的合成方法。

2.2产品的结构确证

硫代吴茱萸次碱（Ⅱ）:

黄色结晶,0.29g,收率:

54.5%,产物色谱纯度:

99.9%;m.p.：

216~218℃,产物Rf值为0.52（薄层色谱展开剂V（PE）:

V（EtOAc）=5:

1）,硅胶柱层析分离纯化,洗脱条件V（PE）:

V（EtOAc）=2:

1;FTIR（KBr），ν/cm-1:

3445（νC-H,Ar—H）,3051（υC-H,CH3）,2920（υC-H,CH2）,2898（υC-H,CH）,1617（υC=O,N—C=O）,1595（υC=C）,1471（δC-H,CH2）,1317（δC-H,CH3）,765（δC-H,Ar—H）。

1HNMR（CDCl3,500MHz），δ:

3.27~3.32（2H,t,J=6.90Hz,NCH2CH2）,5.18~5.22（2H,t,J=6.87Hz,NCH2CH2）,7.16~7.19（1H,m,Ar—H）,7.31~7.34（1H,t,J=7.45Hz,Ar—H）,7.40~7.44（3H,m,Ar—H）,7.68~7.71（1H,t,J=6.95Hz,Ar—H）,9.24（1H,s,NH）;13CNMR（CDCl3,75MHz），δ:

19.90,49.14,112.14,120.26,120.80,125.42,125.92,127.18,127.52,128.9,129.08,131.98,134.58,138.62,188.82。

HRMS:

C18H15N3S[M+H]+理论值:

304.0830,实际值:

304.0864。

N-正丁基硫代吴茱萸次碱（Ⅳa）:

黄色结晶,0.20g,收率:

87.6%,产物色谱纯度:

99.9%;m.p.:

163~165℃;产物Rf值为0.24（薄层色谱展开剂为V（PE）:

V（EtOAc）=1:

1），硅胶柱层析分离纯化，洗脱条件V（PE）:

V（EtOAc）=2:

1;FTIR（KBr），ν/cm-1:

3063（υC-H,Ar—H）,1742（υC=O,N—C=O）,1659（υC=C）,1500（δC-H,CH2）,1404（δC-H,CH3）,743（δC-H,Ar—H）。

1HNMR（CDCl3,300MHz）,δ:

0.97~1.02（3H,t,J=7.38Hz,CH2CH3）,1.29~1.26（2H,m,CH2CH3）,1.85~1.95（2H,m,CH2CH2CH3）,3.21~3.26（2H,t,J=6.66Hz,NCH2CH2）,4.81~4.86（2H,t,J=7.65Hz,NCH2CH2）,5.18~5.22（2H,t,J=6.72Hz,NCH2CH2）,7.16~7.25（1H,t,J=6.93Hz,Ar—H）,7.35~7.48（3H,m,Ar—H）,7.63~7.67（2H,d,J=8.34Hz,Ar—H）,7.70~7.76（1H,m,Ar—H）,8.22~8.85（1H,q,Ar—H）;13CNMR（CDCl3,75MHz）,δ：

13.97,19.87,20.31,32.54,45.09,49.11,110.59,119.56,120.16,123.86,124.73,125.39,126.60,127.51,127.71,128.43,131.93,134.36,140.30,142.32,144.60,188.91。

HRMS:

C22H22N3S[M+H]+理论值:

360.1456,实际值:

360.1490。

N-苄基-硫代吴茱萸次碱（Ⅳb）:

黄色粘稠固体,0.17g,收率:

64.1%,产物色谱纯度:

99.9%;产物Rf值为0.52（